Transformation von Pflanzenmaterial mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes

2.1.12. QIAprep Plasmid-Präparation

Sollte ein kloniertes DNA-Stück sequenziert werden, wurde die Plasmid-Präparation mit dem QIAprep Miniprep Kit von QIAGEN durchgeführt.

Dazu wurden 2 ml (E. coli) Bakterien-Suspension für fünf Minuten bei 2.300 g abzentrifugiert.

Das Pellet wurde in 250 µl Suspensions-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 100 µg/ml RNase A) rückgelöst. Zum Aufschließen der Zellen wurden 250 µl Lyse-Puffer (200 mM NaOH; 1% SDS) zugegeben und alles gut gemischt. Dann wurden 350 µl N3-Puffer zugegeben, sofort sanft gemischt und anschließend bei 13.000 UpM für 10 Minuten inkubiert. Der Überstand wurde auf eine QIAprep Spin Column gegeben und für 60 Sekunden bei 15.800 g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Die Säule wurde zum Waschen mit 500 µl PB-Puffer befüllt und für 60 Sekunden bei 15.800 g zentrifugiert, der Durchfluss wurde verworfen. Die Säule wurde erneut gewaschen mit 750 µl PE-Puffer, mit einer anschließenden Zentrifugation von 60 Sekunden bei 15.800 g. Der Durchfluss wurde wieder verworfen. Um überschüssigen Waschpuffer von der Säule zu entfernen, wurde nochmals für 60 Sekunden bei 15.800 g zentrifugiert. Zur Elution der Plasmid-DNA wurden 50 µl steriles Wasser auf die Säule gegeben, eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert und die DNA in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß durch Zentrifugation von 60 Sekunden bei 15.800 g von der Säule gewonnen. Mit dem UV/VIS-Spektrometer wurde die Konzentration der Plasmid-DNA bestimmt und die Plasmid-DNA dann für Sequenzierungen verwendet.

2.1.13. Sequenzierung

Alle Sequenzierungen wurde von der Firma Eurofins MWG Operon (Martinsried) durchgeführt. Plasmide sollten eine Konzentration von 50-100 ng/µl in einem Gesamtvolumen von 15 µl, Primer von 2 pmol/µl in 15 µl aufweisen.

2.2. Transformation von Pflanzenmaterial mit Hilfe von Agrobacterium

Hitzeschock und die Elektroporation. Beim Hitzeschock werden die Bakterien durch eine kurze Kältebehandlung bei Anwesenheit von divalenten Kationen und anschließender, kurzzeitiger Erwärmung zugänglich für Plasmid-DNA. Bei der Elektroporation werden die Bakterien durch ein elektrisches Feld durchlässig für Plasmid-DNA und nehmen diese auf.

Im Zuge dieser Arbeit wurden die Agrobakterien durch Hitzeschock kompetent gemacht und transformiert.

2-4 ml Übernachtkultur von A. rhizogenes wurden in 2 ml-Reaktionsgefäßen bei 10.000 g für fünf Minuten pelletiert. Der Überstand wurde vorsichtig verworfen, um das lose Pellet nicht zu stören. Man resuspendiert anschließend das Pellet in 100 µl eiskaltem 20 mM CaCl₂, gab etwa 3 µl Plasmid-DNA zu und mischte vorsichtig. Das Reaktionsgefäß mit den Bakterien wurde für fünf Minuten in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend für 25 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 1 ml YMB-M edium wurde der Ansatz für zwei Stunden bei 26 °C unter leichtem Schütteln inkubier t. Die Bakterien wurden daraufhin für zwei Minuten bei 3.000 g sedimentiert und der Überstand vorsichtig bis auf etwa 50 µl entfernt. Das Pellet wurde in den 50 µl Restmedium resuspendiert und auf YMB-Festmedium

mit entsprechendem Antibiotikum ausgebracht. Die Platten mit den transformierten A. rhizogenes wurden für etwa 36-48 Stunden bei 26 °C inkubiert.

2.2.2. Coleus blumei-Pflanzenkulturen

Die aseptischen Pflanzenkulturen wurden aus Samen herangezogen und existieren seit mindestens 20 Jahren. Die einzelnen Linien stammen ursprünglich von jeweils einem Samen ab.

Die Coleus-Pflanzenkulturen wurden steril in Gläsern mit Schraubdeckel auf CB2OH-Agar kultiviert. Alle vier bis sechs Wochen wurden unter sterilen Bedingungen Stecklinge mit Knospe und einem Blattpaar abgeschnitten und in eine neues Glas überführt. Da Coleus blumei leicht Adventivwurzeln bildet, reichte es aus, den Stängel in den Agar zu stecken, um die Kultur zu erhalten. Die Pflanzen wurden im Dauerlicht bei 24 °C kultiviert.

2.2.3. Transformation von Coleus blumei-Blättern mit Agrobacterium rhizogenes

Für die Transformation von Coleus blumei-Blättern mit transformierten Agrobacterium rhizogenes zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Hairy Roots wurden zuerst Übernachtkulturen von Agrobakterien mit den entsprechenden pART27-Konstrukten angeimpft. Nach etwa 36 bis 48 Stunden konnten Blätter steriler Coleus

blumei-Pflanzenkulturen damit infiziert werden. Dazu schnitt man Blätter ab und pipettierte pro Blatt etwa 10 µl Bakteriensuspension auf die Blattunterseite. Zusätzlich wurden mit der Pipettenspitze leicht Verwundungen an den Blättern hervorgerufen damit die Bakterien besser in die Pflanze eindringen konnten und deren Transformationsmechanismus induziert wurde. Vier bis fünf der infizierten Blätter wurden mit dem Blattstiel möglichst aufrecht in auf eine Petrischale (Durchmesser 94 mm) mit CB2OH-Agar gesteckt. Dies verhinderte ein unnötig starkes und unerwünschtes Wachstum der Agrobakterien auf den CB2OH-Platten.

Die Blätter wurden 48 bis 52 Stunden bei Raumtemperatur und herrschendem Tag-Nacht-Rhythmus inkubiert. Dann wurden die Blätter in sterilem Leitungswasser mit 500 µg/ml Cefotaxim gewaschen, mit sterilem Zellstoff leicht getrocknet und auf CB2OH-Agarplatten mit 500 µg/ml Cefotaxim wieder ausgebracht. Die Waschungen mit Antibiotikum wurden alle zwei Tage wiederholt oder wenn wieder ein deutliches Agrobakterienwachstum zu sehen war. Nach ein bis drei Wochen waren die ersten Hairy Roots sichtbar, meist in der Nähe des Blattstiels oder von Blattadern. Ab einer Länge von etwa 0,5 bis 1 cm wurden die Hairy Roots unter sterilen Bedingungen vorsichtig mit einer Federpinzette und einem Skalpell abgeschnitten und einzeln auf CB2OH-Agarplatten (Durchmesser 60 mm) mit 500 µg/ml Cefotaxim und - wenn nötig - mit dem Selektionsmarker Kanamycin (60 µg/ml) ausgebracht.

Die Platten wurden etwa ein- bis zweimal die Woche erneuert, um ein Wachstum der Agrobakterien zu unterbinden. Waren Agrobakterien gewachsen, wurden die Hairy Roots ebenfalls einer Waschung mit Cefotaxim unterzogen. Die Hairy Roots wurden bei 26 °C im Dunkeln kultiviert bis sie eine entsprechende Größe hatten, um einen Teil zur weiteren Kultivierung als Supensionskultur zu entnehmen. Um die Agrobakterien vollständig von den Hairy Roots zu eliminieren, wurde dem CB2OH-Flüssigmedium 500 µl/ml Cefotaxim zugesetzt und die Kulturen bei 26 °C bei 110 UpM ge schüttelt. Das Medium mit dem Antibiotikum wurde für zwei bis drei Wochen jeden zweiten Tag erneuert. Danach waren die Kulturen in der Regel frei von Agrobakterien. Dies wurde anhand einer PCR auf das Agrobakteriengen virC überprüft. Waren die Kulturen frei von Agrobakterien wurden sie in CB2OH-Flüssigmedium ohne Antibiotikum weiterkultiviert. Alle 14 Tage wurden 0,5 g Pflanzenmaterial in frisches Medium überführt. Nach acht bis zehn Wochen war die Hairy Root-Flüssigkultur stabil und für Experimente zu nutzen (Abb. 2.5.).

Abb. 2.5.: (a) aseptische Pflanzenkultur von Coleus blumei; (b) Infiziertes Blatt mit ersten Hairy Roots (siehe Pfeil); (c) Abgeschnittene Hairy Root nach etwa 10 Tagen auf Festmedium; (d) Flüssigkultur der Hairy Roots