2. Material und Methoden
2.4 Methoden
2.4.8 Transfektionsverfahren der mesenchymalen Vorläuferzellen
Als Methode der Wahl wurde das Verfahren der Lipotransfektion eingesetzt. Diese Technik wurde bereits im Labor etabliert und stellt seit vielen Jahren eine bewährte Methode der Transfektion von genetischem Material dar (Felgner et al. 1987). Dieses Verfahren ermöglichte die Transfektion, also das Eindringen von Plasmid-DNA in mesenchymale Vorläuferzellen. Grundlage des Verfahrens ist die Affinität von kationisch geladenen Lipidvesikeln an DNA-Stränge. Die negativ geladenen Phosphat-gruppen der DNA interagieren mit den kationischen Lipiden, auch Dioleoylphosphatidylethanolamine (DOTMA) genannt, diese führen zu einer Komplexbildung. Die Interaktion von Lipidvesikeln und
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Nukleinsäuren wird bestimmt durch hydrophobe Ladungsverhältnisse und Konzentrationen von DNA und Plasmid und Lipidvesikeln (Wong et al. 1996). Des Weiteren ist die Effektivität der Transfektion von multiplen Faktoren abhängig, wie dem DNA / Lipid - Verhältnis und dem elektrischen Potenzial (Zeta-Potential) der Lipidvesikel, welches leicht positiv sein sollte. Diese Faktoren haben einen we-sentlichen Einfluss auf die Effektivität der Transfektion und bereits kleine Änderungen des Versuchs-aufbaus führen zu variablen Ergebnissen (Pires et al. 1999). Es ist in vielen Studien belegt, dass die Transfektion durch kationische Lipide mit einer hohen Zelltoxizität vergesellschaftet ist, die die An-wendung dieser Methode limitiert (Dass 2004). Dies zeigte sich auch im Verlauf der durchgeführten Experimente dieser Arbeit.
Das Transfektionsverfahren wurde im Labor an den mesenchmylalen Vorläuferzellen durchgeführt.
Eine Transfektion der Zellkultur erfolgte 24 h nach Aussaat der Zellen auf die 6-Well-Platten. Die Transfektionsreagenzien stellten sich wie weiter oben beschrieben dar. Grundlage war die Verwen-dung von 6-Well-Platten mit einer Fläche von ca. 9 cm² / Well. Die detaillierte Zusammensetzung und Vorgehensweise der Transfektion verlief nach folgendem Protokoll:
Reaktionsansatz A Reaktionsansatz B
4 μg DNA Plasmid (1 μg / μl Plasmidkonzentra-tion) und 250 μl Opti MEM
10 μl Lipofectamin und 250 μl Opti MEM Tabelle 26. Übersicht der Versuchsansätze
Die beiden Reaktionsansätze wurden separat für 5 Minuten inkubiert und anschließend miteinander vereinigt. Die Inkubation erfolgte für 20 min unter Umweltbedingungen des Inkubators (37° C und 5
% CO₂-Inkubator-Umgebung). In der Zwischenzeit wurden die Wells zweimal mit PBS gewaschen und pro Well 2 ml Vollkulturmedium vorgelegt. Der Lipofectamin-Zell-Mix verblieb 6 Stunden in der Kulturschale und wurde anschließend durch Vollmedium nach vorheriger zweimaliger PBS-Waschung ersetzt.
Transfektionseffizienzkontrolle
Um eine Aussage über die Transfektionseffizienz treffen zu können, war es notwendig, eine separate Kontrolle mit Grün-fluoreszierendem Protein, auch GFP genannt anzulegen. GFP ist ein Protein, das in der naturwissenschaftlichen Bildgebung breite Verwendung findet und dessen cDNA zum ersten Mal 1992 von D. Prashner isoliert und kloniert wurde (Prasher et al. 1992). In dem beschriebenen Transfektionsversuchen wurden dafür Zellen auf sogenannten Chamber Mini Slides mit einer Kon-zentration des jeweiligen Experiments verteilt und entspricht jeweils einem Zehntel der Größe der in Kulturschalen verwendeten Größen. Das GFP-Plasmid wurde auf diese Zellen verteilt. Das GFP eignet sich ausgezeichnet für die Transfektionskontrolle, da es nur 238 Aminosäuren groß ist und ausschließ-lich beim Zebrafisch vorkommt (Chalfie 2009). Des Weiteren ermögausschließ-licht GFP eine Fusion von weite-ren Proteinen, ohne eine Oligomerizierung, und führt zu einer geringeweite-ren Modulation der experimen-tellen Ergebnisse und somit deren Interpretationen (Shaner et al. 2005). Ein entsprechendes Mikroskop zur Detektion und Anregung bei den spezifischen Wellenlängen (s.u.) war in der Abteilung Gastro-enterologie der Universität Göttingen vorhanden. Die Kontrolle der Transfektion erfolgte frühestens
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nach 24 Stunden. Des Weiteren wurde in den folgenden Tagen immer wieder der Verlauf der Emissi-on verfolgt. Die TransfektiEmissi-onseffizienzkEmissi-ontrolle ermöglichte es somit an der lebenden Zelle, eine Aus-sage darüber zu treffen, wieviel Prozent der Gesamtzellen transfiziert sind. Damit kann eine AusAus-sage getroffen werden inwieweit die Real-time-PCR Ergebnisse für die Gesamtzellkultur repräsentabel sind.
Die Anregungsmaxima vom GFP liegen bei etwa bei 395 nm und 475 nm. Das Emissionsmaximum liegt bei ca. 509 nm (Chalfie 2009). Das Verfahren und die Mengen wurden äquivalent an die Ver-suchsbedingungen mit 11-β HSD1-Plasmid angepasst, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu ermöglichen.
Isolierung von genomischer DNA und zytoplasmatischer RNA des gleichen Gewebes
Zur Analyse der Nukleinsäuren musste deren komplexe Struktur verändert werden, um sie einer quali-tativen Untersuchung zugänglich zu machen. Grundlage der Arbeit mit Nukleinsäuren der mesen-chymalen Vorläuferzellen, war die Anwendung von standardisierten Kits der Firma Qiagen©. Mit dem AllPrep DNA / RNA-Mini-Kit wurde die Isolierung von mRNA und RNA mit weniger als 200 Nukleotiden (5.8 S RNA, 5SRNA, tRNAs, die 15 - 20 % der totalen RNA ausmachen) ermöglicht. Die isolierte RNA konnte zu weiteren bioanalytischen Verfahren herangezogen werden, wie cDNA Syn-these und Sybr-Green® Real-time-PCR. Nach Bestimmung des Zellwachstums und Zellzahl wurde der Zellverband aufgebrochen und isoliert. Hierzu wurde das Nährmedium abgenommen, die Zellkul-tur mit PBS gewaschen und Trypsin hinzugegeben, um die Adhärenz der Zellen zu lösen. Die Zellsus-pension wurde in ein Collection Tube überführt und zentrifugiert (1400 UpM für 5 min). Anschließend wurde der Überstand verworfen. Durch Hinzugabe einer adäquaten Menge RLT Puffer Plus (350 oder 650 µl), welcher 1 % β-Mercaptoethanol als RNAse-Inhibitor enthielt, wurden die Zellen aufgebro-chen und die im Zellkern vorliegende mRNA freigesetzt. Anschließend folgten die Arbeitsschritte zur Aufreinigung des Lysats. Die Verwendung von speziellen Drehsäulen ermöglichten eine Auftrennung von DNA und RNA des aufgearbeiteten Zellmaterials. Die gesamte Zellsuspension wurde in die All-Prep Säule für DNA-Isolierung gegeben und für 15 Sekunden bei 10.000 UpM zentrifugiert. Im sog.Flow-through des unteren Cups war nun die eluierte RNA enthalten. Die DNA-Säule wurde bis zur Wiederverwendung bei einer Kühlung von ca. 7° C gelagert. Zur Isolierung der totalen RNA wurde zum eluierten Flow-through jeweils 350 µl 70 % Ethanol hinzugegeben und auf die im Kit mitgeführte MinElute-Säule gegeben. Nach mehreren Arbeitsschritten mit Hinzugabe von RWI Puffer (500 µl), RPE-Puffer (500µl) und 80 % Ethanol auf die Säule, schloß sich eine Zentrifugation bei 10.000 UpM an. Mit offenem Deckel wurde die Säule erneut zentrifugiert (für 5 min bei 13.000 UpM), um sie von restlichen Ethanolrückständen zu befreien. Dann wurde die „RNeasy spincolumn“ in ein neues Collec-tion Tube gegeben und die RNA wird mit 30 - 50 µl RNase-free water eluiert. Es wurde eine Minute bei 10.000 UpM zentrifugiert, um die RNA vollständig zu eluieren.
Zur Isolierung von genomischer DNA wurde der folgende Arbeitsteil angewendet. Die DNA befand sich in der Spin Column Membran, die mit 500 µl Puffer AW1 bei 10.000 UpM für 15 sec. gewaschen
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wurde. Im nächsten Schritt wurde mit AW2 Puffer (500 µl) 2 min bei voller Geschwindigkeit zentri-fugiert, um die Säulenmembran zu waschen. Zur Eluierung der DNA wurde die Säule in ein neues Collection Tube gegeben und nach Hinzugabe von 100 µl EB-Puffer (70° C) für eine Minute zentrifu-giert. Gegebenenfalls konnte eine erneute Eluierung durch Zugabe weiterer Mengen EB-Puffer erfol-gen.