Transfektion

Um Nukleinsäuren in den Zellkern einer Zielzelle einzuschleusen, bedarf es eines effizienten Transfektionssystems. Hierfür wurden drei verschiedene Transfektionssysteme getestet und schließlich genutzt. Namentlich handelt es sich dabei 1) um die Lipofektion mittels Lipofectamine 2000 von Invitrogen, 2) um die Mikroporation mittels Microporator von Peqlab und 3) um die Nukleofektion mit dem human chondrocyte nucleofector kit von AMAXA.

Lipofektion

Seit Felgner et al. 1987 die Möglichkeit des Nukleinsäuretransports in Zellen via kationischen Lipiden, sogenannten cationic liposomes (CLs), zeigen konnten, wurde dieses Verfahren vielfach in Zellkulturen, Tiermodellen und in vivo genutzt (Dass 2004).

Man geht davon aus, dass kationische Phospholipide in hydrophiler Umgebung Lipidvesikel mit einer doppelschichtigen Phospholipidmembran bilden, an die sich die negativ geladenen Nukleinsäuren anlagern und als sogenannte Lipoplexe oder cationic lipid-nucleic acid complexes (CLNACs) Zellmembranen, vergleichbar mit Endosomen, penetrieren können.

Intrazellulär fusionieren diese Endosomen entweder mit der Kernmembran und entlassen so die Nukleinsäuren direkt ins Karyoplasma oder sie werden in lysosomalen Prozessen abgebaut und entlassen so die Nukleinsäuren ins Zytoplasma.

Moderne Transfektionsreagenzien, wie z.B. das in dieser Arbeit verwendete Lipofectamine 2000, bestehen meistens aus einem Gemisch von kationischen und neutralen Lipiden. Der Anteil der neutralen Lipide, im Falle des Lipofectamines das gebräuchliche Dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), hilft im Fusionsprozess der Lipide zum Vesikel und stabilisiert jenes, was von besonderer Bedeutung ist, da sich die kationischen Lipide aufgrund ihrer positiven Ladung voneinander abstoßen (Hafez et al. 2001, Zuidam und Barenholz 1998). Liposomen ohne einen Anteil neutraler Lipide haben niedrigere Transfektionsraten als Liposomen mit neutralen Lipiden, wie Mui et al. 2000 zeigen konnten.

Vorteile der Lipofektion sind gute Handhabung und geringe Zytotoxizität (z.B. im Vergleich zur Elektroporation), wobei geringe Transfektionsraten in primären Zellen und in einigen Zelllinien sich als nachteilig erwiesen haben. Für die Transfektionsrate sind unter anderem das Verhältnis verschiedener Lipide, das Lipid/Nukleinsäureverhältnis und die Größe der Nukleinsäuren entscheidend (Dass 2004).

Praktische Durchführung der Lipofektion:

Vor der Transfektion wurden ca. (0,5 – 1)*10⁵ Zellen in 6-Well-Platten ausgesät und bis zu einem Konfluenzgrad von 90–95% kultiviert. Für die Transfektion wurden 2 Ansätze (Ansatz A und Ansatz B) pro Well wie folgt angesetzt.

Tab. 17: Übersicht über den Lipofektionsansatz

Reagenz Ansatz A Ansatz B

Inkubation (RT) 15min 5min

Beide Ansätze wurden vereinigt und bei Raumtemperatur 15min inkubiert. Währenddessen wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 1,5ml OptiMem bedeckt. Das Transfektionsreagenz wurde nun tröpfchenweise auf die Zellen gegeben und durch vorsichtiges Schwenken auf dem Zelllrasen verteilt. Das Transfektionsmedium wurde, je nach Versuch, für 3-24h auf den Zellen belassen, wobei standardmäßig nach 3h 1,5ml Vollmedium mit doppeltem FCS (20%), ohne Antibiotikum hinzupipettiert wurde.

Mikroporation, Nukleofektion und Elektroporation

Sowohl die Mikroporation als auch die Nukleofektion basieren auf dem Prinzip der Elektroporation. Diese Methode wurde erstmals 1982 als Möglichkeit des Gentransfers in Mauszellen von Neumann et al. publiziert (Neumann et al. 1982). Während sich in den Anfängen die Anwendung der Elektroporation größtenteils auf die Transformation von Bakterien beschränkte, ist sie heute eine etablierte Methode um RNA, DNA aber auch eine große Bandbreite anderer Moleküle wie zum Beispiel Ionen oder sogar Antikörper in Zellen einzuschleusen. Dies gelang sowohl in vitro, in vivo als auch in Patienten (Gehl 2003).

Durch Applikation eines Spannungspulses an Zellen wird die Zellmembran kurzzeitig destabilisiert, sodass sie für exogene Moleküle permeabel wird. Die Effizienz dieses Vorgangs ist unter anderem abhängig von der Spannungsstärke, der Dauer und der Anzahl der Spannungspulse sowie dem Elektroporationspuffer.

Praktische Durchführung der Mikroporation:

Bei der Mikroporation mit dem Microporator von Peqlab wird eine spezielle Pipettenspitze mit einer Goldelektrode als Reaktionsraum der Elektroporation genutzt. In dieser Arbeit wurden 10-µl-Pipettenspitzen benutzt.

Die Zellen wurden von dem Kulturgefäß abtrypsiniert und mit PBS gewaschen. Nach Abzentrifugation wurden die Zellen in Resuspensionspuffer in einer Konzentration von 5*10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Aus dieser Zellsuspension wurden ca. 120µl in 1,5-ml-Reaktionsgefäße vorgelegt und mit 4µg Plasmid-DNA vermischt. Dieses Gemisch wurde mit der Elektroporationspipettenspitze aufgenommen. Nach Transfektion unter den unten angegebenen Bedingungen wurden die transfizierten Zellen in vorgewärmtes Medium gegeben.

Tab. 18: Mikroporationsprotokoll:

Spannung Pulslänge Pulszahl

99V 40ms 1

Praktische Durchführung der Nukleofektion:

Die Transfektionen mittels Nukleofektion wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Miosge, Georg-August-Universität Göttingen, durchgeführt. Es wurde hierfür das human chondrocyte nucleofector kit von AMAXA benutzt.

Die zu transfizierenden Zellen wurden mittels Zellschaber von dem Kulturgefäß abgelöst und in ein 15-ml-Falconröhrchen überführt. Diese Zellsuspension wurde abzentrifugiert, in 1ml PBS resuspendiert und die Zellzahl wurde ermittelt.

Pro Transfektionsansatz wurden 5*10⁵ Zellen in 15-ml-Falconröhrchen gegeben und abermals abzentrifugiert. Um eine hohe Toxizität zu vermeiden, wurden die nachfolgenden Schritte für jeden Transfektionsansatz nacheinander ausgeführt: Das Zellpellet wurde in 100µl Chondrocyte Nucleofector Solution (inkl. Supplement) resuspendiert und je nach Experiment mit 2-5µg DNA, bzw. 2,5µg siRNA, bzw. 2-5µl H₂O_dest gemischt. Diese Suspension wurde in die mitgelieferte Einmalküvette überführt und mit dem Programm U-24 im Nucleofector transfiziert. Zu dieser Suspension wurde nun nach der Transfektion 500µl auf 37°C vorgewärmtes Vollmedium mit 20%FCS in die Küvette gegeben. Der volle Ansatz wurde nun mit der mitgelieferten Einmalpipette aus der Küvette entnommen und tröpfchenweise gleichmäßig in 1,5ml, auf 37°C vorgewärmtes, Medium mit 20% FCS gegeben. Nach 24-stündiger Kultivierung wurde ein Mediumwechsel mit Medium und 10%

FCS gemacht.