Thrombozyten-Granulozyten-Interaktionen

Gesunden Freiwilligen wurden etwa 5 ml Blut entnommen. Die ersten 2 ml Blut wurden verworfen, um bei der Entnahme aktivierte Thrombozyten zu vermeiden. Als Antikoagulanz wurde Natriumcitrat in einer Endkonzentration von 0,38% zugesetzt. Zur Aktivierung der Thrombozyten wurde das Blut bei 37°C für 5 min mit ADP in einer Endkonzentration von 10 µM inkubiert und anschließend mit HMO oder Oligosaccharid-Standards versetzt und weiter inkubiert. Sowohl die Expression relevanter Granulozyten-Adhäsionsmoleküle als auch die Thrombozyten-Granulozyten-Komplexbildung wurden konfokalmikroskopisch dargestellt. Der Einfluss der Oligosaccharide auf die Wechselwirkungen zwischen Thrombozyten und Granulozyten wurde durchflusszytometrisch untersucht.

3.5.1 Konfokalmikroskopische Charakterisierung

3.5.1.1 Markierung mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern

Zur Lyse der Erythrozyten wurden 50 µl des ADP-stimulierten Blutes für 2 min mit 250 µl FACS-Lyse inkubiert. Durch die anschließende Zugabe von 250 µl FACS-Fix wurde die Zelllyse gestoppt und die Zellen fixiert. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur für 5 min bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und erneut bei Raumtemperatur für 5 min bei 150 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet entweder zur Darstellung der Granulozyten-Adhäsionsmoleküle oder zur Darstellung der Thrombozyten-Granulozyten-Komplexbildung mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert.

3.5.1.1.1 Granulozyten-Adhäsionsmoleküle

Das Pellet wurde in 10 µl mouse anti-human CD11b:FITC oder mouse anti-human CD15s:FITC (1:1 in FACS-Wash) resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss wurde der Ansatz mit 1 ml PBS versetzt, für 5 min bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand mit den ungebundenen Antikörpern verworfen.

Das Pellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert, erneut für 5 min bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zur Kernfärbung wurde das Pellet anschließend in 2 µl TO-PRO-3 Iodid (1:10 in FACS-Wash) resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation unter Lichtausschluss wurde der Ansatz mit 1 ml PBS versetzt und für 5 min bei 150 x g

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 50 µl PBS resuspendiert und anschließend ein Mikroskopie-Präparat erstellt.

3.5.1.1.2 Thrombozyten-Granulozyten-Komplexbildung

Das Pellet wurde in 10 µl mouse anti-human CD62P (1:1 in FACS-Wash) resuspendiert.

Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min wurde der Ansatz mit 1 ml PBS versetzt, für 5 min bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand mit den ungebundenen Antikörpern verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und erneut für 5 min bei 150 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 µl des Sekundärantikörpers goat anti-mouse:Cy5 (1:10 in FACS-Wash) resuspendiert. Nach 10-minütiger Inkubation unter Lichtausschluss wurde der Ansatz mit 1 ml PBS versetzt, für 5 min bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand mit den ungebundenen Antikörpern verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und erneut für 5 min bei 150 x g zentrifugiert. Zum Blockieren freier Bindungsstellen des Sekundärantikörpers wurde das Pellet in 50 µl Mausserum (5% in PBS; inaktiviert) resuspendiert. Nach 10-minütiger Inkubation unter Lichtausschluss wurde der Ansatz mit 1 ml PBS versetzt, für 5 min bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand mit den ungebundenen Serumproteinen verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und erneut für 5 min bei 150 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 µl mouse anti-human CD11b:FITC (1:1 in FACS-Wash) resuspendiert. Nach 10-minütiger Inkubation unter Lichtausschluss wurde der Ansatz mit 1 ml PBS versetzt, für 5 min bei 150 x g zentrifugiert und der Überstand mit den ungebundenen Antikörpern verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und erneut für 5 min bei 150 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 50 µl PBS resuspendiert und anschließend ein Mikroskopie-Präparat erstellt.

3.5.1.2 Erstellung der Mikroskopie-Präparate

Jeweils 20 µl der mit Antikörpern markierten Zellsuspensionen wurden auf einen mit Poly-Lysin beschichteten Objektträger aufgebracht, im Inkubator bei 37°C getrocknet und somit fixiert. Zur Verstärkung der Fluoreszenzintensität wurden etwa drei Tropfen Citifluor auf den Objektträger aufgebracht, das Präparat mit einem Objektgläschen bedeckt und mit handelsüblichem Nagellack versiegelt. Die Objekte wurden bis zur mikroskopischen Betrachtung bei -20°C gelagert.

Methoden

3.5.1.3 Konfokalmikroskopische Darstellung

Die Präparate wurden mit einem Konfokal-Laser-Scanning-Mikroskop bei 400-facher optischer Vergrößerung mit den entsprechenden Filtern dargestellt. FITC wurde bei einer Wellenlänge von 433 nm mit einer relativen Laserintensität von 50% angeregt und die emittierte Strahlung in einem Wellenlängenbereich zwischen 450 und 550 nm gefiltert und als Signal gebündelt. Cy5 und TO-PRO-3 Iodid wurden bei einer Wellenlänge von 633 nm mit einer relativen Laserintensität von 15% bzw. 6% angeregt und die emittierte Strahlung in einem Wellenbereich zwischen 650 und 750 nm gefiltert und als Signal gebündelt. Pro optischem Schnitt wurde das Signal von 16 Aufnahmen gemittelt. Drei optische Schnitte (0,5 µm) wurden aufgenommen und mit der Leica Confocal Imaging-Software überlagert.

3.5.2 Durchflusszytometrische Bestimmung

50 µl des mit ADP-stimulierten und teilweise mit Oligosacchariden inkubierten Vollblutes wurden bei 37°C unter Lichtausschluss für 10 min mit 5 µl des Granulozyten-Aktivitätsmarkers mouse anti-human CD11b:FITC (1:1 in FACS-Wash) und 10 µl des Thrombozyten-Markers mouse anti-human CD42a:PerCP (1:1 in FACS-Wash) inkubiert.

Anstelle dieser Antikörper wurde zur Bestimmung unspezifischer Antikörperbindungen ein weiterer Ansatz mit den Isotypen-Negativkontrollantikörpern anti-mouse IgG1:FITC und anti-mouse IgG2a:PerCP inkubiert. Danach wurde das Blut zur Lyse der Erythrozyten für 2 min mit 250 µl Lyse versetzt. Durch die anschließende Zugabe von 250 µl FACS-Fix wurde die Zelllyse gestoppt und die Zellen fixiert. Die Zellsuspension wurde nach dem Prinzip der direkten Zweifarbenimmunofluoreszenz am Durchflusszytometer mit den folgenden Einstellungen analysiert (PETERS et al. 1997):

Parameter Spannung [mV] Amplifikation [-] Modus

FSC [Filter E-1] 5,5 Lin

SSC 377 1,0 Lin

FL-1 505 - Log

FL-3 560 - Log

Um die Detektion von Zelltrümmern zu minimieren wurde für FSC ein Schwellenwert von 135 definiert. Wegen der gleichzeitigen Messung von FL-1 und FL-3 wurde eine Kompensation der Parameter vorgenommen (FL-1/FL-2 -0,9%; 1 -24%; FL-2/FL-3 0%; FL-FL-2/FL-3/FL-2 15%).

Die Zellen wurden bei höchster Fließgeschwindigkeit analysiert. Granulozyten wurden anhand ihrer Größe und Granularität eingegrenzt. Die Daten für jeweils 5.000 dieser so eingegrenzten Messereignisse wurden gesammelt.

Zur Bestimmung unspezifischer Antikörperbindungen wurde bei der Messung der mit dem Isotypen-Negativkontrollantikörper anti-mouse IgG1:FITC markierten Zellen das Signal für den Parameter FL-1 so amplifiziert, dass nahezu alle Zellen eine Fluoreszenzintensität von unter 10¹ aufwiesen. Gleiches wurde für den Parameter FL-3 mit den anti-mouse IgG2a:PerCP markierten Zellen durchgeführt. Eine gemessene Fluoreszenzintensität, die 98% der Intensität der jeweiligen Isotypen-Negativkontrollen überstieg, wurde als spezifische Antikörperbindung gewertet.

Messereignisse, die sowohl mit dem Granulozyten-Marker CD11b als auch mit dem Thrombozyten-Marker CD42a markiert waren, wurden als Thrombozyten-Granulozyten-Komplexe gewertet. Zur Bestimmung der Effekte der verschiedenen Oligosaccharide auf die Thrombozyten-Granulozyten-Komplexbildung wurde die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) für CD42a der ADP-stimulierten Probe mit Inkubation von Oligosacchariden (MFI (CD42a)ADP+Oligosaccharide) mit der MFI der ADP-stimulierten Kontrolle ohne Inkubation mit Oligosacchariden (MFI (CD42a)ADP) in Relation gesetzt:

MFI (42a)ADP+Oligosaccharide

MFI (42a)ADP

x 100%

Zur Quantifizierung der Granulozyten-Aktivität wurde die MFI für CD11b der ADP-stimulierten Probe mit Inkubation von Oligosacchariden (MFI (CD11b)ADP+Oligosaccharide) mit der MFI der ADP-stimulierten Kontrolle ohne Inkubation mit Oligosacchariden (MFI (CD11b)_ADP) in Relation gesetzt:

MFI (11b)ADP+Oligosaccharide

MFI (11b)_ADP

x 100%

Methoden