Im dritten Teil dieser Arbeit wurde versucht ATP- und ADP- Bindungsstellen nicht durch praktische Versuche, sondern durch theoretische Überlegungen näher zu bestimmen.
In der Literatur sind einige Sequenzmotive beschrieben, von denen bekannt ist, daß sie Adenosinreste erkennen und binden (Tabelle 12).
Tabelle 12: Adenosinbindende Sequenzmotive
Sequenzmotiv Adenosinhaltige Gruppe Literatur
GITPA ADP Edel et al. (1992)
EHTDVA ADP Edel et al. (1992)
GDGXX[T/S] ATP Ewart et al. (1991)
KTX6[V/I] ATP Walker et al. (1982)
GGYAKEM NADH Yamaguchi and Hatefi (1995)
GxGxx[V/G/A] NADH Olausson et al. (1993)
Hu et al. (1992)
GxGVAG NADH Olausson et al. (1993)
Um Bindungsstellen für Adeninnukleotide bei der COX zu finden, wurde eine Annahme gemacht. Da alle Sequenzmotive dasselbe Substrat erkennen, sollten sie ähnliche Strukturelemente enthalten. Obwohl die meisten der Motive mehrmals die Aminosäure Glycin enthalten, ist es nicht nötig, daß Glycin im Motiv vorkommt. Da ähnliche räumliche Strukturen durch verschiedene Aminosäuresequenzen erzeugt werden können, wurde nach Sequenzen in der COX-Struktur gesucht, die strukturelle Homologien zu den Motiven besitzen. Zu diesem Zweck wurde ein Computerprogramm entworfen, daß die Homologiesuche durchführte. Die Kriterien für die Suche waren, neben der Ladung der jeweiligen Aminosäure, die Polarität, der aromatische Charakter, die Größe der Seitenkette, helixbildende oder brechende Eigenschaften sowie faltblattbildende oder -brechende Charakteristika. Durch die Suche wurden viele Sequenzstücke innerhalb der COX gefunden, die Homologien zu einem oder mehreren Motiven zeigten. Die Annahme, daß die Bindungsstellen für Adeninnukleotide eine gemeinsame Struktur besitzen, bedingt, daß eine Bindungsstelle der COX Homologien zu mehreren Motiven besitzt. Dazu wurden die Ergebnisse der Homologiesuche grafisch aufgetragen (Figuren 59 und 60).
0 50 100 150 200 0
2 4
6 Untereinheit II
Aminosäure
0 100 200 300 400 500
0 2 4
6 Untereinheit I
Homologien
Aminosäure
0 50 100 150 200 2500
2 4 6 Homologien
Homologien
Untereinheit III
Aminosäure
20 40 60 80 100 120 140 0
2 4 6
Untereinheit IV
Homologien
Aminosäure
0 20 40 60 80 100 0
2 4 6 Homologien Untereinheit Va
Aminosäure
20 40 60 80
0 2 4
6 Untereinheit Vb
Homologien
Aminosäure
20 40 60 80 0
2 4 6
Homologien
Untereinheit VIa
Aminosäure
Figur 59: Grafische Darstellung der Ergebnisse der Homologiesuche für die Untereinheiten I - VIa der Rinderherz-COX. Die Linie in den einzelnen Plots trennt Bereiche hoher Homologien (oberhalb) von denen geringerer Homologien (unterhalb) ab.
0 20 40 60 80 0
2 4 6
Homologien
Aminosäure Untereinheit VIb
0 10 20 30 40 50 60 70 0
2 4 6
Homologien
Aminosäure Untereinheit VIc
10 20 30 40 50
0 2 4 6
Homologien
Aminosäure Untereinheit VIIa
0 10 20 30 40 50 0
2 4 6
Homologien
Aminosäure Untereinheit VIIb
0 10 20 30 40
0 2 4 6
Homologien
Aminosäure Untereinheit VIIc
0 10 20 30 40 0
2 4 6 Homologien
Aminosäure Untereinheit VIII
Figur 60: Grafische Darstellung der Ergebnisse der Homologiesuche für die Untereinheiten VIb -VIII der Rinderherz-COX. Die Linie in den einzelnen Plots trennt Bereiche hoher Homologien (oberhalb) von denen geringerer Homologien (unterhalb) ab.
Bei genauerer Betrachtung der Ergebnisse fällt auf, daß zwar viele Sequenzbereiche in der Untereinheit I Homologien zu einer oder zwei der Sequenzmotive aufzeigen, sich aber kein Bereich als besonders homolog zu vielen Motiven herauskristallisiert hat. Ähnliches gilt für die restlichen Untereinheiten der COX. Es gibt jedoch 6 Ausnahmen.
In der Untereinheit III gibt es zwei Bereiche um die Aminosäure 200 herum, die hohe Homologien zu den untersuchten Motiven aufweisen. Dabei handelt es sich zum einen um den Sequenzbereich von Aminosäure 189 - 195 (SDGVYGS) sowie um den Bereich von Aminosäure 200 - 205 (ATGFHG). Betrachtet man diese beiden Motive in der Raumstruktur, so sind beide Motive Bestandteile der Helix 6 der Untereinheit III. In beiden Fällen ist die nähere Umgebung dicht von anderen Aminosäuren der COX umgeben, so daß eine Bindung von ADP an diesen Stellen sehr unwahrscheinlich erscheint.
Innerhalb der Untereinheit IV gibt es auch einen Bereich, der Ähnlichkeiten zu mehreren der Sequenzmotive aufweist. Dieser Bereich reicht von Aminosäure 130 - 135 (PIQGFS) und liegt auf der cytosolischen Seite der COX in der Nähe der Untereinheit II. Hier gibt es Raum genug, um ein ADP-Molekül optisch in die Struktur der COX zu fitten. Dabei ergibt sich die Möglichkeit, daß der negativ geladene Diphosphatrest des ADP durch das Arg134 der Untereinheit II stabilisiert wird (Figur 61). Falls dies tatsächlich eine ADP- oder ATP-Bindungsstelle sein sollte, könnte dieser Argininrest für die unterschiedliche Reaktion auf die Bindung von ADP oder ATP verantwortlich sein.
Figur 61: Hypothetische Bindungsstelle für ADP oder ATP an der Untereinheit IV der COX. Grün:
Untereinheit IV, gelb: Untereinheit VIc, blau: Untereinheit II, rot: Untereinheit VIIb, mehrfarbig:
ADP-Molekül. Nicht bindungsrelevante Gebiete der COX sind ausgeblendet.
Figur 62: Mögliche Bindungsstelle an der Untereinheit Vb der COX aus Rinderherz. Hellblau:
Untereinheit Vb, rot: Untereinheit VIIa, dunkelblau: Untereinheit III, gelb: Untereinheit VIa, bunt : ADP-Molekül. Für die Bindung nichtrelevante Gebiete der COX sind ausgeblendet.
Die vierte mögliche Adeninnukleotidbindungsstelle, die die Homologiesuche ergeben hat, liegt auf der Untereinheit Vb von Aminosäure 3 - 8 (GGGVPT).
Diese Untereinheit liegt auf der Matrix-orientierten Seite der COX. Das optisch gefittete ADP-Molekül ist mit dem Diphosphatrest zwischen Helix 2 und 3 der Untereinheit III orientiert, wobei die negative Ladung von Arg59 oder Arg80 dieser Untereinheit stabilisiert werden könnte (Figur 62). Der freie Raum, der diese Bindungsstelle umgibt, reicht aus, um ein ATP-Molekül aufzunehmen, wodurch der Triphophatrest näher an die beiden Argininreste gelangen würde.
Die beiden letzten möglichen Bindungsstellen sind beide auf der Untereinheit VIa lokalisiert und sind bereits in der Literatur beschrieben worden.
Die eine Bindungsstelle liegt auf der N-terminalen, matrixorientierten Seite und wird von den Aminosäuren 9 - 14 (GGTGAR) gebildet und entspricht in etwa der Bindungsstelle, die bereits von Tsukihara (1996) beschrieben wurde (Figur 63).
Figur 63: Bindungsstelle an der herzspezifischen Untereinheit VIa aus Rinderherz. Der optische Fit wurde nach den Daten von Tsukihara et al. (1996) angefertigt. Rot: Untereinheit VIa, blau:
Untereinheit I des zweiten Monomers in der Dimerstruktur, mehrfarbig: ADP-Molekül. Für die Bindung nichtrelevante Gebiete der COX sind ausgeblendet.
Die letzte potentielle Bindungsstelle liegt auf der dem Cytosol zugewandten Seite der Untereinheit VIa in dem Bereich von Aminosäure 63 - 68 (GDGNHT).
Dieses Sequenzstück ist Teil der von Taanman et al. (1994) vorausgesagten ADP/ATP - Bindungsstelle im Bereich von Aminosäure 63 - 75. Die Phosphatgruppen des Nukleotids können dabei zwischen die Helices 2 und 6 der Untereinheit III orientiert sein (Figur 64).
Figur 64: Optischer Fit für die Bindung von ADP an die Untereinheit VIa. Die für die Bindung der Adeningruppe zuständigen Aminosäuren entsprechen den Daten von Taanman et al. (1994). Rot:
Untereinheit VIa, grün: Untereinheit III, blau Untereinheit I, bunt: ADP-Molekül. Für die Bindung nicht relevante Gebiete der COX sind ausgeblendet.
Insgesamt zeigte die computergestützte Suche nach Homologien zwischen bekannten Adenosinbindenden Motiven und der COX 6 Bereiche, von denen zwei aus strukturellen Gründen nicht für die Bindung geeignet sind. Die Übereinstimmung zwischen den beiden sich auf der VIa befindenden Bindungsstellen mit bereits in der Literatur beschriebenen Bindungsstellen, belegt, daß der Ansatz über ähnliche Strukturmerkmale bei Adenosinbindungsstellen nicht völlig von der Hand zu weisen ist.
4 Diskussion
4.1 Untersuchungen zur Bestimmung von ATP- und