Termination

Neben den bereits angeführten Pausierungsstellen wird die Transkription an bestimmten Terminationssequenzen angehalten. Es kommt zu einer Destabilisierung des RNA-DNA-Hybrids. Dies führt wiederum zum Auflösen des EK, und die RNAP steht wieder für eine erneute Transkription zur Verfügung (Henkin, 1996; Henkin, 2000; Ciampi, 2006). Bei der Termination wird zwischen der intrinsischen und der Rho-abhängigen unterschieden, wobei beide Mechanismen erst nach einem vor-herigen Pause-Zustand der RNAP aktiv werden können (Greive und von Hippel, 2005; Landick, 2006). Die Termination erfolgt nicht durch Blockierung der RNAP-Bewegung auf der DNA, sondern über die transkribierten RNA-Elemente (Martin und Tinoco, 1980; Lesnik et al., 2001). Diese indirekte Termination führt dazu, dass Terminationssequenzen anhand der Effizienz des Signals und der Verweildauer der RNAP am Terminationssignal charakterisiert werden (Neuman et al., 2003).

Für die intrinsische Termination werden keine zusätzlichen Proteine benötigt. Die Terminationssequenz besteht, ähnlich den pause-sites, aus einer Haarnadelschleife (Terminationsschleife), mit nachfolgender Uridin-reicher Sequenz. Dies ermöglicht die Schwächung des RNA-DNA-Hybrids (Lesnik et al., 2001; Nudler und Gottesman, 2002; Nudler und Gusarov, 2003). Durch die Destabilisierung des Hybrids, wie auch durch die Haarnadelschleife, werden konformationelle Änderungen in der RNAP

Termination 13 induziert. Das Warten der RNAP erlaubt die korrekte Faltung der Terminations-schleife (Gusarov und Nudler, 1999). Der detaillierte Mechanismus der intrinsischen Termination konnte bis dato noch nicht eindeutig geklärt werden. So existieren drei Modelle, die den EK während dieser Phase beschreiben sollen. Das im Augenblick präferierte allosterische Modell beruht auf der Interaktion der Terminationsschleife mit strukturellen Elementen des RNA-Exit-Kanals, β-Klappe und β’-Zink-Finger.

Dadurch werden Konformationsänderungen hervorgerufen, die das RNA-DNA–

Hybrid weiter destabilisieren und zu einem Zusammenbrechen der Transkriptions-blase führen (Abb. 1-6; (Toulokhonov et al., 2001; Epshtein et al., 2007; Greive et al., 2008; Larson et al., 2008)).

Abbildung 1–6: Allosterisches Modell der intrinsischen Termination

A) Die Ausbildung der Terminationsschleife wird bei Pausierungsstellen durch β’-Zink-Finger und β-Klappe unterstützt und führt zu einer Aufweitung des RNA-Exit-Kanals.

B) Die Haarnadelschleife hat ihre endgültige Größe von etwa 7-8 bp erreicht. Dadurch wird die Transkriptionsblase aufgeweitet, und die Terminationsschleife interagiert mit der Trigger-Schleife. Dies führt zu einer Verkürzung des RNA-DNA-Hybrids auf etwa 3 bp. Zusätzlich wird durch die Haarnadelschleife die DNA-Klemme geöffnet, so dass neben der naszierenden RNA auch die DNA die RNAP verlassen kann (Epshtein und Nudler, 2003; Nudler, 2009).

Beim sogenannten RNA-Scher-Modell wird davon ausgegangen, dass das Heraus-ziehen der RNA aus der Transkriptionsblase durch die Terminationsschleife zum Auflösen des RNA-DNA-Hybrid führt und zusätzlich Konformationsänderungen der RNAP induziert (Macdonald et al., 1993; Toulokhonov und Landick, 2003). Das dritte Modell nimmt an, dass durch die Terminationsschleife die RNAP stromaufwärts geschoben wird, jedoch ohne eine entsprechende Transkription durchzuführen. Dies führt zum sogenannten ’hyper-translozierten’ Stadium, das mit einem verkürzten RNA-DNA-Hybrid einhergeht und so den EK destabilisiert (Yarnell und Roberts, 1999; Santangelo und Roberts, 2004).

Die zweite Art der Termination ist vom ρ-Faktor (Roberts, 1969), einem homo-hexameren und ringförmig angeordneten Protein, abhängig. ρ ist essentiell für das

Termination 14

Überleben der Zellen, was auf seiner Rolle als globaler Regulator der Genexpression beruht (Cardinale et al., 2008). Funktionell besitzt ρ eine ATP getriebene 5’-3’-RNA-DNA-Helikase, die es ihm ermöglicht, entlang der RNA in Richtung RNAP zu gelangen, das RNA-DNA-Hybrid aufzuschmelzen und so die Polymerase von der DNA abzulösen (Brennan et al., 1987; Richardson, 2002). Diese Translokation wird durch NusG unterstützt, das ρ zur RNAP hin rekrutiert (Sullivan und Gottesman, 1992; Pasman und von Hippel, 2000). Die Erkennungssequenz von ρ besteht aus der rho-utilization (rut) Sequenz, die entweder aus einer 30 nt langen cytidinreichen Sequenz oder einer Haarnadelschleife (Schneider et al., 1993) sowie der strom-abwärtsgelegenen Terminationssequenz besteht (70-80 nt), die jedoch lokal nicht eindeutig abgegrenzt ist (Alifano et al., 1991; Banerjee et al., 2006).

Die amino-terminale Domäne der ρ-Monomere enthält die primäre

RNA-Bindungs-stelle (Bogden et al., 1999). Die carboxy-terminale Domäne besteht aus der P-Schleife, die für die ATP-Hydrolyse wichtig ist, der Q- und der R-Schleife, welche

die sekundäre RNA-Bindestelle bilden (Burgess und Richardson, 2000; Burgess und Richardson, 2001). Durch die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie konnte gezeigt werden, dass die RNA schleifenartig entlang des Rings von den einzelnen Untereinheiten gebunden wird, und dass das 3’-Ende der RNA zur Ringmitte hin orientiert wird (Abb. 1-7A; (Skordalakes und Berger, 2003)).

Interessanterweise öffnet sich der Hexamerring um etwa 12 Å nach dieser Primär-bindung und gibt so die sekundären RNA Bindestellen im Inneren des Hexamers frei.

Nun kann die RNA durch den Ring hindurchgefädelt werden, woraufhin der Ring wieder eine geschlossene Struktur einnimmt (Yu et al., 2000; Kim und Patel, 2001;

Skordalakes und Berger, 2003; Skordalakes und Berger, 2006). Angetrieben von der ATP-Hydrolyse kann sich ρ in dieser Form entlang der RNA zum EK hinbewegen, wobei der genaue Mechanismus hierfür noch nicht geklärt ist. Die eigentliche Termination, induziert durch das Aufschmelzen des RNA-DNA-Hybrids, erfolgt sehr wahrscheinlich wie es auch für die intrinsische Termination postuliert wurde (Abb.

1-7B; (Greive und von Hippel, 2005; Skordalakes und Berger, 2006)).

Antitermination 15

Abbildung 1–7: RNA-Bindung von ρ und Mechanismus der ρ-abhängige Termination A) Schematische Bindung der RNA an die primären Bindungsstellen in der amino-terminalen Domäne von ρ (cyan). Die carboxy-terminalen Domänen sind in rot dargestellt und die RNA als schwarze Linie (Skordalakes und Berger, 2003).

B) Nach der ATP-getriebenen 5’-3’-Translokation von ρ entlang der RNA, kann ρ mit der RNAP interagieren. Termination wird durch die Destabilisierung des RNA-DNA-Hybrids induziert; wahrscheinlich durch strukturelle Änderungen innerhalb der RNAP und/oder aktive Verkürzung des Hybrids (nach (Greive und von Hippel, 2005)).