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C- terminale Ssp1-eGFP Fusion pSH15
Mit den Primern SH22-NdeI und SH17 wurde mit pSH4 als Matrize ein 1659 bp großes Fragment amplifiziert, dass des ssp1-ORF von Position +1523 bis zum Stop-Codon umfasst, dass durch eine NdeI-Schnittstelle ersetzt wird.
Das Fragment wurde zwischenkloniert, sequenziert und daraus schließlich ein 611 bp SacI-NdeI Fragment isoliert, das einen Teil des Ssp1 C-Terminus beinhaltet. eGFP wurde aus pSH14 mittels der Primer SH-eGFP-AscI und OAN7 als 700 bp Fragment amplifiziert, und durch gerichtete PCR-Mutagenese wurde eine NdeI-Schnittstelle am ATG und eine AscI-Schnittstelle nach dem Stop-Codon eingesetzt.
eGFP wurde als NdeI-AscI-Fragment isoliert.
Aus pSH4 wurde ein 243 bp MluI-NsiI Fragment aus dem ssp1 3’-Bereich isoliert.
Alle Fragmente wurden in pSL1180 (SacI-NsiI) ligiert.
pSH16
Dieses Konstrukt beinhaltet einen den C-Terminus von Ssp1 kodierenden Bereich als translationale eGFP Fusion, danach die ssp1-Polyadenylierungsstelle und danach die HygR. PSH15 wurde mit NsiI und BglII restringiert und mit der HygR-Kassette (2985 bp, NsiI-P m l I) aus pSLHyg(-) und einem 611 bp SnaBI-BglII Fragment aus pSH4 (ssp1 3’-Bereich) ligiert.
Überproduktion von ssp1 pSH-o2tef-1#11
Aus pCU4 (A. Brachmann, 2001) wurde der o2tefPromoter als 903 bp N o t I N d e I -Fragment isoliert. Mit den Primern SH12 und SH20 wurde ein 835 bp Fragment aus dem ssp1-ORF amplifiziert, wodurch durch gerichtete PCR Mutagenese eine N d e I
-Schnittstelle am ssp1-ATG eingeführt wurde.
Nach Restriktion mit NdeI und HpaI wurde ein 187 bp NdeI-HpaI Fragment isoliert. Aus pSH4 wurde ein 1492 bp H p aI-EcoRI Fragment aus dem s s p 1-ORF isoliert. Die Fragmente wurden in geschnittenen pBS-SKII+ (NotI-EcoRI) ligiert.
pSH-o2tef-hyg-2
Dieses Plasmid enthält einen Teil des ssp1 5’-Bereichs, danach die HygR, danach den o2tef-Promoter als Fusion an die N-terminalen Sequenzen von ssp1. Aus pSH4 wurde ein 1247 bp AscI-X m n I Fragment aus dem 5’
Bereich von ssp1 isoliert. pSLHyg+ (A.
Brachmann, 2001) wurde mit XhoI verdaut, die Schnittstelle mit Klenow-Enzym aufgefüllt, mit NotI nachgeschnitten und die Hygromycin-B Resistenzkassette als 2974 bp XhoI-„blunt“-N o t I-Fragment isoliert. Aus pSH-o2tef-1#11 ein 1688 bp NotI-EcoRI-Fragment isoliert (o2tef-Promoter mit N-terminalem Teil von ssp1). Die Fragmente wurden in pNEB193 (AscI-EcoRI) ligiert.
pSH-crg1-1#2
Aus pRU12 (A. Brachmann, 2001) wurde der c r g 1 -Promoter als 1468 bp NotI-NdeI Fragment isoliert. Mit den Primern SH12 und SH20 wurde ein 835 bp Fragment aus pSH4 amplifiziert, wodurch durch gerichtete PCR Mutagenese eine NdeI-Schnittstelle am ssp1 ATG eingeführt wurde. Nach Restriktion mit NdeI und XhoI wurde ein 268 bp NdeI-XhoI
Fragment isoliert. Aus pSH6 wurde ein 1004 bp XhoI-BamHI Fragment aus dem ORF von ssp1 isoliert. Die Fragmente wurden in den mit NotI und BamHI restringierten Vektor pBS-SKII+ ligiert.
pSH-crg1-hyg-2
Diese Plasmid beinhaltet einen Teil des ssp1 5’-Bereichs, danach die HygR, danach den crg1-Promoter als Fusion an die N-terminalen Sequenzen von ssp1. Aus pSH4 wurde ein 1247 bp AscI-X m n I Fragment aus dem 3’
Bereich von ssp1 isoliert. pSLHyg+ (A.
Brachmann, 2001) wurde mit XhoI verdaut, die Schnittstelle mit Klenow-Enzym aufgefüllt, mit NotI nachgeschnitten und die Hygromycin-B Resistenzkassette als 2974 bp XhoI-„blunt“-N o t I-Fragment isoliert. Aus pSH-crg1-1#2 wurde ein 2740 bp NotI-BamHI Fragment isoliert (cr1g-Promoter und N-terminaler Teil des ssp1 Gens). Die Fragmente wurden in den mit N o t I und BamHI restringierten Vektor pBS-SKII(+) ligiert.
ssp1-Promotoranalyse
pSH-P-1
Beinhaltet den ssp1 5’-Bereich von Position –2589 bis +1 fusioniert an eGFP. Der Vektor pRU3 (A. Brachmann, 2001) wurde mit HpaI und NotI verdaut und die 4.4 kb Vektorbande isoliert. Aus dem Plasmid pSH14 wurde ein 1802 bp EcoRI-NotI-Fragment isoliert, welches 1070bp ssp1 5’ Bereich fusioniert an eGFP enthält. Aus dem Vektor pSH4 wurde ein 1525 bp EcoRV-EcoRI Fragment aus dem ssp1 5’ Bereich isoliert. Die Fragmente wurden ligiert, so dass das neue Plasmid ca.
2.6 kb ssp1 5’ Bereich fusioniert an eGFP beinhaltet.
pSH-P-2
Beinhaltet den ssp1 5’-Bereich von Position –1655 bis +1 fusioniert an eGFP. Der Vektor pRU4 (A. Brachmann, 2001) wurde HpaI-NotI verdaut und die 4.4 kb Vektorbande isoliert.
linearisiert, die Schnittstelle mit Klenow aufgefüllt, anschließend wurde mit NotI geschnitten und ein 2380 bp MluI-„blunt“-NotI Fragment (1655 bp ssp1 5’ Region und 725 bp eGFP) in pRU4 ligiert.
pSH-P-3
Beinhaltet den ssp1 5’-Bereich von Position –1062 bis +1 fusioniert an eGFP. Der Vektor pRU4 (A. Brachmann, 2001) wurde HpaI-NotI verdaut und die 4.4 kb Vektorbande isoliert.
Das Plasmid pSH-P-1 wurde mit EcoRI linearisiert, die Schnittstelle mit Klenow aufgefüllt, anschließend wurde mit NotI restringiert und ein 1787 bp E c o
RI-„aufgefüllt“-NotI Fragment (1062 bp ssp1 5’
Region und 725 bp eGFP) in pRU4 ligiert.
pSH-P-4
Beinhaltet den ssp1 5’-Bereich von Position
pRU4 (A. Brachmann, 2001) wurde HpaI-NotI verdaut und die 4.4 kb Vektorbande isoliert.
Das Plasmid pSH-P-1 wurde mit Hind III linearisiert, die Schnittstelle mit Klenow aufgefüllt, anschließend wurde mit NotI geschnitten und ein 1355 bp Hind
III-„aufgefüllt“-NotI Fragment (630 bp ssp1 5’
Region und 725 bp eGFP) in pRU4 ligiert.
pSH-P-5
Beinhaltet den ssp1 5’-Bereich von Position –2143 bis +1 fusioniert an eGFP. Der Vektor pRU4 (A. Brachmann, 2001) wurde HpaI-NotI verdaut und die 4.4 kb Vektorbande isoliert.
Das Plasmid pSH-P-1 wurde mit NaeI und NotI geschnitten und ein 2868 bp NaeI-NotI Fragment (2143 bp ssp1 5’ Region und 725 bp eGFP) isoliert und in pRU4 ligiert.
pSH-P-6
Beinhaltet den ssp1 5’-Bereich von Position –1869 bis +1 fusioniert an eGFP. Der Vektor pRU4 (A. Brachmann, 2001) wurde HpaI-NotI verdaut und die 4.4 kb Vektorbande isoliert.
Das Plasmid pSH-P-1 wurde mit BsaAI und NotI geschnitten und ein 2594 bp NaeI-NotI Fragment (1869 bp ssp1 5’ Region und 725 bp eGFP) isoliert und in pRU4 ligiert.
pSH-P-7
Beinhaltet den ssp1 5’-Bereich von Position –2589 bis –2143 fusioniert an –1869 bis +1, der vor das e G F P Gen kloniert wurde. Der Vektor pRU4 (A. Brachmann, 2001) wurde NaeI-NotI verdaut eine 4865 bp Bande isoliert.
pSH-P-1wurde mit NotI-BsaAI verdaut und ein 2594 bp Fragment isoliert. Beide Fragmente wurden ligiert. Der Vektor beinhaltet den ssp1-5’ Bereich mit einer 274 bp Deletion zwischen den früheren N a e I- und BsaAI-Schnittstellen fusioniert an eGFP.
pssp1-cisI-mfa1#22
Beinhaltet ein 455 bp Fragment aus dem ssp1 5’-Bereich (-2589 bis –2143) fusioniert an den mfa1-Basalpromoter und eGFP. Das Plasmid pUMA13 wurde mit BamHI geschnitten, die Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und dephosphoryliert. Aus pSH4 wurde ein 443 bp EcoRV - N a e I-Fragment aus dem s s p 1-5’
Bereich isoliert und in obigen Vektor als in der wie im wt Locus vorliegenden 5’-3’
Orientierung kloniert.
pssp1-cisI-mfa1#7
Beinhaltet ein 455 bp Fragment aus dem ssp1 5’-Bereich (–2143 bis -2589) fusioniert an den mfa1-Basalpromoter und eGFP. Das Plasmid pUMA13 wurde mit BamHI geschnitten, die Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und dephosphoryliert. Aus pSH4 wurde ein 455 bp EcoRV - N a e I-Fragment aus dem s s p 1-5’
Bereich isoliert und in obigen Vektor ligiert.
pssp1-cisII-mfa1#28
Beinhaltet ein 720 bp Fragment aus dem ssp1 5’-Bereich (-2589 bis -1869) fusioniert an den mfa1-Basalpromoter und eGFP. Das Plasmid pUMA13 wurde mit BamHI geschnitten, die Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und dephosphoryliert. Aus pSH4 wurde ein 720bp EcoRV-BsaAI-Fragment (ssp1-5’ Bereich) isoliert und in obigen Vektor in 5’-3’
Orientierung kloniert.
pssp1-cisII-mfa1#35
Beinhaltet ein 720 bp Fragment aus dem ssp1 5’-Bereich (-1869 bis -2589) fusioniert an den mfa1-Basalpromoter und eGFP. Das Plasmid pUMA13 wurde mit BamHI geschnitten, die Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und dephosphoryliert. Aus pSH4 wurde ein 720bp EcoRV-BsaAI-Fragment (ssp1-5’ Bereich) isoliert und in umgekehrter Orientierung ( 5’-3’) kloniert.
pET-System: Ssp1-Expression in E. coli
pET-Ssp1#9
Dieses Plasmid beinhaltet das gesamte ssp1 Gen mit einem N-terminalen His-Epitop. Mit den Primern SH30-NdeI und SH6 wurde ein 676 bp Fragment aus dem s s p 1 ORF amplifiziert, in den Vektor pCR2.1 kloniert und anschließend sequenziert. Aus diesem Vektor pTopo-NdeI-ATG#4 wurde ein 181 bp großes NdeI-HpaI Fragment isoliert und zusammen mit einem 1492 bp H p aI-EcoRI Fragment aus dem pSH4 in den Vektor pSL1180 ligiert, wodurch das Plasmid pSL-EcoRI-NdeI#4-1 entstand. Aus pSH4 wurde ein 1569 bp großes E c o RI-SalI Fragment isoliert, die SalI-Schnittstelle mit T4-DNA Polymerase aufgefüllt und das Fragment anschließend in den mit E c oRI und SmaI restringierten Vektor pSL1180 kloniert. Aus diesem Plasmid pSL-ssp1-BamHI-EcoRI#11 wurde ein 1585 bp EcoRI-BamHI Fragment isoliert und zusammen mit einem 1673 bp NdeI-EcoRI Fragment aus pSL-EcoRI-N d e I#4-1 in einer 3-Fragmentligation in pET15b kloniert, wodurch der Vektor pET-Ssp1#9 entstand.