Synthese eines Antigens für polyklonale Antikörpers gegen fC

Nukleoside werden standardmäßig an Proteine über eine Aktivierung von Carboxylgruppen oder Phosphatgruppen mit wasserlöslichem EDC∙HCl gekuppelt. Die aktivierten Carbonsäuren oder Phosphate bilden mit den primären Aminen der Lysine stabile Amid- bzw.

43

Phosphoramiditbindung aus.^[114] Eine weitere gebräuchliche Kupplungsstrategie für Nukleoside ist eine oxidative Periodatspaltung nach Erlanger und Beiser. Hierbei werden die cis-Diolgruppen von RNA-Zuckern durch Behandlung mit Natriumperiodat zu den Aldehyden

umgesetzt. Durch eine reduktive Aminierung können die Aldehyde mit der primären Aminogruppe von Lysinen kovalent verknüpft werden.^[115]

Zur Generierung eines polyklonalen Antikörpers gegen fC wurde das Monophosphat des fCs synthetisiert (Schema 2.3-1). Anschließend wurde das Monophosphat durch Aktivierung mit EDC∙HCl an die primären Lysine des Trägerproteins KLH gekuppelt.

Schema 2.3-1 Herstellung eines fCMP-Antigens aus KLH und fCMP. Synthese des 5`-fC-Monophosphats aus dem freien fC-Nukleosid. Nach der Phosphorylierung an der 5`-Position mit POCl3 in PO(OMe)3 kann das Monophosphat über eine EDC-Kupplung an das Trägerprotein angebracht werden.

Die Synthese des freien fC-Nukleosids 5 erfolgte wie bereits beschrieben ausgehend von TBS-geschützem 5-Iod-dC 2 durch eine Stille-Kupplung und anschließender TBS-Entschützung.^[39]

Das Monophosphat 8 wurde aus dem freien Nukleosid mit Hilfe des Protonenschwamms POCl3

in PO(OMe)3 als Lösungsmittel nach Yoshikawa et al. synthetisiert.^[99] Nach Aufreinigung mittels Umkehrphasen-HPLC konnte das Monophosphat in 29 %-iger Ausbeute isoliert werden.

Die Kupplung an KLH und Immunisierung von Hasen wurde durch die Firma Diogenode durchgeführt. Die finalen Antikörper-Seren wurden gegen synthetisierte Oligonukleotide, die die Modifikationen dC, mC, hmC, fC und caC enthielten, in einem Dot-Blot Assay getestet.

Hierfür wurden die Oligonukleotide bei 80°C an eine Membran „gebacken“, die Membran mit Milchpulver geblockt und mit dem Antikörperserum behandelt. Nach anschließender Behandlung mit einem sekundären Antikörper sollte die Chemilumineszenz visualisiert werden. Abb. 2.3-2 zeigt das Ergebnis eines solchen Antikörpertests. Als Ergebnis bleibt festzuhalten, dass das Antikörperserum unspezifisch mit den getesteten Oligonukleotiden reagierte.

44

Abb. 2.3-2 Darstellung des Dot-blot assays mit synthetischen Oligonukleotiden (38 mer, Sequenz: 3`- GTA GCC AGG TCG CAC GCG TGC TAX GAT GCG AGACTG C-5`), die je einmal die Modifikation X (C, mC, hmC, fC und caC) enthalten. In einem weiteren Oligonukleotid der gleichen Sequenz wurde caC viermal eingebaut (4 x caC). Die verwendeten ssDNA-Mengen sind in [pmol] angegeben. (A) Dot blot assay mit fC-Monophosphat-Antikörper-Serum. (B) und (C) Dot blot assay mit Antikörpern der Frima Active Motif, die als Antigen die Ribo-Form der Nukleoside fC (B) und caC (C) verwendet haben.

Gleichzeitig wurden zum Vergleich kommerziell erhältliche Antikörper gegen fC und caC von Active Motif getestet. Die Nukleoside wurden hier durch Periodatspaltung der Ribo-Form der Nukleoside und anschließende reduktive Aminierung an die primären Amine gekuppelt.^[21b]

Während der caC-Antikörper eine gute Spezifität und Reaktion mit den caC-enthaltenden Oligonukleotiden zeigte, reagierte das kommerziell erhältliche fC-Antikörperserum nicht mit den fC-enthaltenden Oligonukleotiden (siehe Abb. 2.3-2 B). Das caC trägt eine negative Ladung, die offenbar immunogen ist. Man sieht in Abb. 2.3-2 C, dass der caC-Antikörper mit Oligonukleotiden, welche ein caC (1 x caC) beinhalten reagiert. Auch mit einem Oligonukleotid, welches mehrere caC (4 x caC) enthält, zeigte sich eine Bindung. Es lässt sich ein Dosis-Effekt erkennen. Durch einen Mehrfacheinbau von caC wird auch ein stärkeres Antikörper-Signal erhalten. Im Vergleich dazu stellt die fC-Base mit der ungeladenen Aldehydgruppe offenbar kein ausreichend immunogenes Hapten dar. Ein ähnliches Problem tritt auch mit hmC auf. Für die Generierung eines hmC-Antikörpers wurde daher zum Beispiel eine Strategie entwickelt, bei der die ungeladene Hydroxylgruppe mit einer geladenen Sulfonsäuregruppe maskiert wurde, um sie in ein stärkeres Immungen zu verwandeln.^{[46, 116]}

Ebenso könnte die Entfernung der fC-Base vom Trägerprotein eine entscheidende Rollte

45

spielen. So könnte eventuell der Einbau eines Linkers zwischen fC und Trägerprotein eine bessere Immunantwort hervorrufen.

Für das fC wurde zunächst versucht, die Aldehydgruppe in ein stärkeres, geladenes Antigen zu verwandeln (siehe Abb. 2..3-3). Im Arbeitskreis stand ein Hydroxylamin-Reagenz „Superfly“

von Dr. Toni Pfaffeneder zur Derivatisierung von Aldehydgruppe von abasischen Stellen in DNA zur Verfügung. Dieses Reagenz trägt eine permanente positive Ladung, die höchst immunogen wirken sollte und aufgrund des negativ geladenen Phosphatrückgrats gut mit Aldehydgruppen in DNA reagieren sollte.

Abb. 2.3-3 Derivatisierung der Formylgruppe des fC mit dem Hydroxylamin-haltigem Superfly Reagenz.

Für die Anwendung eines solchen Reagenzes muss das zu untersuchende Gewebe bzw. die DNA zunächst mit diesem Reagenz und anschließend mit dem Antikörperserum behandelt werden.

Zur Immunisierung wurde eine entsprechend derivatisiertes fC-Nukleosid 41 synthetisiert. Als Kupplungsstrategie an Trägerproteine wurde eine Periodatspaltung nach Erlanger und Beiser gewählt, die über die ribo-Form des Nukleosids realisiert wurde.^[117] Die entsprechende Synthese ist in Schema 2.3-2 dargestellt.

46

Schema 2.3-2 Synthese eines derivatisierten ribo-fC-Nukleosids. Als Reagenz für die Derivatisierung wurde das

„Superfly-Reagenz“ verwendet. a) mCPBA, I2, DMF/Pridin, RT, 2 h, 43 %, b) TBSCl, Imidazol, DMF, RT, 16 h, 74 % , c) Pd2(dba)3·CHCl3, PPh3, Bu3SnH, 3.5 bar CO, Toluol, 60°C, 60 %, d) HF-Pyridin, Pyridin, RT, 16 h, 95 % e) Hydroxylamin-Superfly, 2 mM Anillin, H2O, RT, 16 h, 23 %.

Das Ribonukleosid wurde über analoge, vom 2`-Desoxynukleosid bekannte Syntheseschritte (siehe Schema 2.3-2) hergestellt. Ausgehend von Cytidin wurde die 5-Position in einer Ausbeute von 43 % oxidativ iodiert. Das Produkt 42 wurde in einer Ausbeute von 43 % erhalten. Die Schützung der Alkoholgruppen wurde mit TBSCl durchgeführt. Es wurde ein Gemisch aus zweifach und dreifach geschützten Nukleosid 43 erhalten, wobei mehr zweifach geschütztes Nukleosid entstand. Eine vollständige Schützung war vermutlich aus sterischen Gründen nicht möglich. Die kombinierte Ausbeute des geschützten Nukleosids 43 betrug dennoch 74 %. Sie könnte vermutlich durch die Verwendung einer Silylklammer an der 2`-und 3`-Hydroxygruppe verbessert werden. Anschließend wurde die Stille-Kupplung durchgeführt, die das Aldehyd-Nukleosid 44 in 60 %-iger Ausbeute generierte. Anschließend wurden die TBS-Schutzgruppen zu 45 unter Standardbedingungen abgespalten. Hiernach wurde die Aldehydgruppe mit dem Hydroxylaminreagenz Superfly unter Anilin-Katalyse irreversibel zu dem Zielmolekül 41 umgesetzt und über Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Hierbei war es wichtig, ein gepuffertes Laufmittelsystem zu verwenden, um eine Elution des Produkts zu gewährleisten. Die Konjugation an KLH durch eine Periodatspaltung und die Immunisierung wurde durch Active Motif durchgeführt. Zuvor wurde getestet, ob das Antigen die Bedingungen für die Kupplung an das Trägerprotein übersteht. Hierzu wurde das synthetisierte fC-Superfly-Konjugat 41 mit den für die Periodat-Kupplung erforderlichen Bedingungen inkubiert. HRMS-ESI und eine analytische HPLC-Analyse zeigten, dass die derivatisierte Base bei diesen

47

Bedingungen nicht beschädigt wird. Die polyklonalen Antikörperseren wurden von Active Motif bereitgestellt.

Für die Validierung mittels Dot Blot Assays wurden synthetische Oligonukleotide hergestellt, die unterschiedliche Anzahlen an fC-Basen (1xfC, 4xfC, 6xfC) enthielten. Diese Oligonukleotide wurden mit Superfly umgesetzt und überschüssiges Reagenz wurde durch ein von Dr. Toni Pfaffender entwickeltes Protokoll, das mehrere Wasch- und Fällungsschritte beinhaltet, entfernt. Der dazugehörige Dot Blot Assay ist in Abb. 2.3-4-A dargestellt. Das polyklonale Serum reagiert selektiv nur mit Oligonukleotiden, die fC beinhalten, dass mit Superfly behandelt wurde.

In dem nächsten Validierungschritt wurden als Kontrollen nicht fC-haltige Oligonukleotide (38 mere) mit Superfly behandelt (siehe Abb. 2.3-4-B). Diese zeigten ebenso eine Reaktion mit dem Serum, obwohl das Reagenz vollständig entfernt wurde (Analytik mittels TripleQuad). In Abb. 2.3-4-C ist dargestellt, dass der Antikörper mit unbehandelter synthetischer DNA, die fC enthält, nicht reagiert. Abb. 2.3-4-C, zeigt, dass im gleichem Maße DNA, die mit Superfly behandelt wurde, die aber kein fC enthält (S-C, Sa-C) mit dem Antikörper reagiert.

Abb. 2.3-4 Ergebnisse des Dot-blot assays mit synthetischen Oligonukleotiden (38 mer, Sequenz: 3`- TTA-GAG-CAT-XTA-TXT-ATX-TAT-XTA-TXT-ATX-TAC-AAA-GG-5`), die je einmal oder mehrmals die Modifikation X (C, mC, hmC, fC und caC) enthielten. Einige Oligonukleotide wurden mit dem Hydroxylamin-Reagenz Superfly

48

umgesetzt, das die Formylgruppe von fC markieren soll. Die verwendeten ssDNA-Mengen sind in [pmol]

angegeben. (A) Dot blot assay mit fC-Superfly-Antikörper-Serum und fC-Oligonukleotiden bzw. fdC-Nukleosiden, die mit Superfly umgesetzt wurden. (B) und (C) Dot blot assay mit Antikörpern der Firma Active Motif, die als Antigen die Ribo-Form der Nukleoside fC (B) und caC (C) verwendet haben.

Eine Erklärung hierfür könnten die oxidativen Bedingungen bei der synthetischen Festphasen-DNA-Synthese sein, die in kleinsten, durch MALDI und HPLC nicht mehr nachweisbaren Mengen Aldehydgruppen an der DNA erzeugt.

Um dies zu vermeiden, wurden enzymatisch PCR-Produkte (150 bp) mit unterschiedlichem fC-Gehalt generiert. Hierfür wurde das dCTP in der PCR-Reaktion teilweise durch fCTP ersetzt (siehe Abb. 2.3-5).

Abb. 2.3-5 Darstellung der Gelelektrophorese der PCR Produkte (150 bp) von fC und dC. Reihe 0: PCR-Marker, Reihe 1 bis 5 PCR-Produkte mit abnehmenden Gehalt an fdC. (1) 45 % fC, (2) 30 % fC, (3) 13 % fC, (4) 6 % fC, (5) 2.4 % fC.

Anschließend wurde der hypothetische Wert mit dem realen Wert an fC verglichen. Hierfür wurden die PCR-Produkte zu Nukleosiden verdaut und der fC-Gehalt durch quantitative LC-MS-Messungen bestimmt.

Tab. 2.1 PCR-Produkte aus Reaktionen mit verschiedenen fCTP:dCTP Verhältnis und Vergleich des theoretischen mit den tatsächlichen Prozenten von fC an dC-Modifikationen im PCR-Produkt.

PCR fdC Gehalt theor. [%] fdC Gehalt [%]

1 80 45

2 50 30

3 25 13

4 12.5 6

5 6.25 2.4

Die Abweichung des theoretischen mit dem realen Gehalt an fC zeigt, dass offenbar dC bevorzugt von der verwendeten Polymerase eingebaut wird. Der prozentuale Wert von 2.4 %

49

fC im PCR-Produkt 5 bedeutet, dass sich in dem 150 mer insgsamt nur ca. 2 fC-Modifikationen befinden.

Kontroll-PCR Produkte ohne fC wurden gleichermaßen mit Superfly behandelt. Überschüssiges Reagenz wurde mit 1-Naphthaldehyd abgefangen und mit Waschschritten nach dem Protokoll von Dr. Toni Pfaffeneder entfernt. Der erhaltene Dot-Blot Assay ist in Abb. 2.3-6 dargestellt.

Während der Antikörper sehr stark mit fC-haltigen PCR-Produkten reagiert, zeigte er keine Reaktion mit dC-haltigen Kontroll-PCR Produkten.

Abb. 2.3-6 Darstellung des Dot-blot assays mit PCR-Produkten (150 bp, Oct4-Promotor) mit unterschiedlichen Gehalt an fC (xx % fC). Diese PCR-Produkte wurden z.T. mit dem Hydroxylamin-Reagenz Superfly umgesetzt (S). Die verwendeten DNA-Mengen sind in [ng] angegeben. Das mutmaßliche Antigen (fC-Protein-Superfly-Konjugat) ist rechts im Bild dargestellt. C-S: Kontroll-PCR-Produkt ohne fdC, das mit Superfly umgesetzt wurde. Kontrolle 1: fC-PCR-Produkt, das mit einem unreaktiven, mit 1-Naphthaldehyd abgefangenen Hydroxylamin-Reagenz Superfly umgesetzt wurde. Kontrolle 2: dC-PCR-Produkt, das mit einem unreaktiven, mit 1-Naphthaldehyd abgefangenen Hydroxylamin-Reagenz Superfly umgesetzt wurde.

Da das Superfly-Reagenz neben mit fC auch mit abasischen Stellen in der DNA reagiert, müssen für weitere Validierungen PCR Produkte hergestellt werden, die abasische Stellen enthalten. So kann eine Kreuzreaktion des Antikörpers mit DNA, die mit Superfly abgesättigte abasische Stellen enthält auszuschließen. Für deren Herstellung könnte dUTP in vergleichbaren Mengen zu den fCTP-Produkten in PCR-Produkte eingebaut und diese mit der Glykosylase UDG ausgeschnitten werden. Anschließend müssten diese Produkte mit Superfly behandelt und überschüssiges Reagenz mit Waschschritten entfernt werden.

50