Zur Entwicklung einer FRET-Sonde der sauren Sphingomyelinase wurden zwei verschiedene Ansa tze verfolgt.
Abb. 3-1 | Ansatz A | Darstellung des Sphingomyelin-Analogons 9 als potentielle FRET-Sonde der ASM mittels SMS-katalysierter Umesterung des Phosphodiesters zwischen NBD-markiertem Phosphatidyldesmethylcholin 6 und im Sphingosin-Ru ckgrat NR-markiertem Ceramid 7.
Ansatz A verfolgte die Imitation der Sphingomyelin-Biosynthese wie sie in Abb. 3-1 dargestellt ist. Vermittelt durch die Sphingomyelin-Synthase (SMS) sollte dazu die NBD-haltige Kopfgruppe eines fluoreszent markierten Phosphatidyldesmethylcholins 6
auf ein NR-markiertes Ceramid 7 u bertragen werden. Das so gewonnene Phospholipid 9 sollte im Anschluss auf seine Eignung als Substrat der sauren Sphingomyelinase (ASM) getestet werden. Der Charme dieser konvergenten Methode liegt darin, aus einfach Fluoreszenz-markierten synthetischen SMS-Substraten durch einen enzymatischen Schritt die angestrebte ASM-Sonde zu generieren und dabei mo glicherweise fu r beide Enzyme (SMS und ASM) nu tzliche Nachweismethoden zu entwickeln. Zur Synthese der Ausgangsverbindungen konnte großenteils auf publizierte Ergebnisse und Erfahrungen aus der Arbeitsgruppe zuru ckgegriffen werden. Kurz zusammengefasst sollten ein Phosphatidylcholin-Analogon 6 mit dem Fluoreszenzfarbstoff NBD in der Kopfgruppe und ein etabliertes, mit NR markiertes Ceramid 7 in Gegenwart u berexprimierter Sphingomyelinsynthase aus Hefezelllysaten zur Reaktion gebracht werden. Die Synthese des NBD-markierten Phosphatidylcholin-Analogons 6 erwies sich als anspruchsvoll, es gelang jedoch die Isolation kleiner Mengen der beno tigten Verbindung. Das im Sphingosin-Ru ckgrat NR-markierte Ceramid 7 konnte in Anlehnung an Literatur-vorschriften[119] in ausreichenden Mengen dargestellt werden. Dieser Ansatz lieferte aufgrund von Problemen bei der finalen enzymatischen U bertragung der NBD-haltigen Kopfgruppe nicht das geplante Moleku l 9 und wird hier nur der Vollsta ndigkeit halber erwa hnt. Wahrscheinlich waren die Modifikationen an den Substraten zu drastisch um die Substraterkennung durch die SMS aufrechtzuerhalten. Zusa tzlich erschwerten das Vorliegen alternativer natu rlicher Substrate im lysathaltigen Reaktionsmedium und die damit einhergehende statistische Verteilung mo glicher Produkte die Gewinnung substanzieller Mengen des gewu nschten zweifach markierten Sphingomyelins 9. Trotz der geschilderten Probleme wurden speziell fu r die Darstellung unsymmetrischer Phosphodiester mittels H-Phosphonat-Chemie[91] und ihre sa ulenchromatographische Trennung wertvolle Erkenntnisse gewonnen, die spa tere Synthesen von H-Phosphonaten verschiedener Sphingosin-Analoga erleichterten. Besonders erwa hnenswert ist die Nu tzlichkeit des Reagenzes 2-Chlor-5,5-dimethyl-1,3,2-dioxaphosphorinan-2-oxid (NPCl) zur Kondensation eines ersten Alkohols mit Phosphonsa ure, sowie zur anschließenden Kondensation des gebildeten H-Phosphonates mit einem zweiten Alkohol. Einige im Rahmen dieses Ansatzes synthetisierte, neue Verbindungen sind im experimentellen Teil erfasst.
Ansatz B verfolgte die vollsynthetische Darstellung der geplanten ASM-Sonde, wobei sowohl die Anzahl der notwendigen linearen Stufen als auch ihre Gesamtzahl deutlich
stieg. Zuna chst galt es, praktikable Methoden und eine Schutzgruppenstrategie zu etablieren, die die Synthese von 9 erlauben. Dabei konnte jedoch keine Strategie gefunden werden, die es erlaubte zuna chst NR im Sphingosin-Teil des Moleku ls zu installieren und im Anschluss einen Phosphodiester zu knu pfen. Da auch der umgekehrte Fall praktisch nicht durchfu hrbar war, wurde ersatzweise eine Strategie zur Einfu hrung der NR-Markierung im Fettsa urerest (siehe Abb. 3-2) entwickelt. Zwar liegt so zwischen den beiden Fluorophoren eine zusa tzliche, potentiell enzymlabile Amid-Gruppe, jedoch vermeidet dieses Arrangement mo gliche Probleme bei der Substraterkennung durch die ASM, denn dort zeigt natu rliches Sphingomyelin eine gewisse Variationsbreite, wa hrend das Sphingosin-Ru ckgrat invariant auftritt. In diesem Teil des Moleku ls sollte die geplante Modifikation folglich eher toleriert werden. Zudem verringerte sich auf diese Weise die Anzahl der zu handhabenden lichtempfindlichen Intermediate drastisch.
Abb. 3-2 | Ansatz B | Darstellung der angestrebten FRET-Sonde mittels chemischer Totalsynthese. Gezeigt ist ein U berblick u ber die retrosynthetische Zerlegung von Sonde 1 in kommerziell verfu gbare Synthesea quivalente, PG = Schutzgruppe.
Nach Analyse des neuen Zielmoleku ls (einen beispielhaften U berblick zeigt Abb. 3-2) wurde ein modularer Syntheseplan entworfen und in folgende Teilschritte gegliedert, die im folgenden Abschnitt (Kapitel 3-1-1 bis 3-1-5) na her diskutiert werden:
1.)Synthese der Cholin-ähnlichen Kopfgruppe 2.)Synthese fluoreszierender Fettsäurederivate
3.)stereoselektive Synthese von Sphingosin mittels Olefinmetathese 4.)Knüpfung des Phosphodiesters
5.)Installation der Fluorophore
Der dargelegte Syntheseplan wies einige Unwa gbarkeiten auf, denn fu r die meisten Syntheseschritte (z.B. die Synthese des asymmetrischen Phosphodiesters) existierten nur entfernt a hnliche Vorarbeiten, deren U bertragung auf das spezielle Problem aufgrund des Lipidcharakters des Zielmoleku ls nur eingeschra nkt mo glich war. Im Verlauf der Arbeiten ergab sich die Notwendigkeit, den NR-Fluorophor durch 7-Methoxycumarin-3-carboxylat (MCC) zu ersetzen. Da die Einfu hrung der fluoreszenzmarkierten Fettsa ure jedoch auf der letzten Stufe der Synthese erfolgt, waren dazu keine Aba nderungen der Syntheseroute er-forderlich. Faktisch bietet das letzte Intermediat dieser Route die gro ßtmo gliche Freiheit beliebige (modifizierte) Carbonsa uren am Amin-Stickstoff zu installieren. Dadurch ist eine gegenu ber Ansatz A deutlich erho hte Flexibilita t gegeben, die eine zuku nftige Weiterentwicklung der hier vorgestellten Sonden z.B. durch Austausch des Fluorophors oder Verringerung/Erho hung der Zahl der Methyleneinheiten der Fettsa ure erleichtert.
In den folgenden Abschnitten wird die Synthese der Sonde diskutiert, wobei an einigen Stellen Teile der letztendlich nicht erfolgreichen, aber dokumentationswu rdigen Versuche, etwa zur Synthese von Sphingosyl-H-phosphonaten vorgestellt werden.
3-1-1 | Synthese der Cholin-ähnlichen Kopfgruppe
Um das natu rliche ASM-Substrat Sphingomyelin in Hinblick auf Polarita t und Raum-anspruch bestmo glich nachzuahmen, wurde zuna chst eine kleine Kollektion maskierter und NBD-markierter Cholin-Pra kursoren generiert (siehe Abb. 3-3). Dabei erschwerte die hohe Polarita t der gebildeten Amin- und Ammoniumverbindungen ihre Gewinnung in ausreichender Menge und Reinheit. In einigen Fa llen leisteten Kristallisation oder Vakuumdestillation gute Dienste. In den u brigen Fa llen wurde auf
Normalphasen-chromatographie in Verbindung mit alkoholisch-wa ssrigen mobilen Phasen zuru ckge-griffen. Die gezeigten Verbindungen wurden mittels 1H-, 13C- und ggf. 31 P-NMR-Spektroskopie sowie HRMS charakterisiert.
Abb. 3-3 | Syntheseschema zur Darstellung einer Kollektion markierter und geschu tzter Aminoethanol-Derivate als Pra kursoren der Cholin-a hnlichen Kopfgruppe der angestrebten FRET-Sonde.
Zum Aufbau des 2-(2-Aminoethyl(methyl)amino)ethanol-Grundko rpers 11 erfolgte zuna chst eine STRECKER-a hnliche Reaktion von 2-(Methylamino)ethanol mit Formaldehyd und Kaliumcyanid in Bisulfitlauge (Abb. 3-3). Sie lieferte das beno tigte Nitril 10 nach einfacher organischer Extraktion der wa ssrigen Reaktionsmischung in hervorragender Ausbeute. Im Anschluss wurde 10 mit LiAlH4 reduziert und mittels Kugelrohrdestillation das gewu nschte Intermediat 11 in exzellenter Ausbeute von 87% mit hoher Reinheit erhalten. Diese Verbindung wurde entweder mit Boc2O maskiert um 12 zu gewinnen oder mit NBDCl zum fluoreszierenden Derivat 13 umgesetzt. Es gelang, aus mit CHCl3 unterschichteter methanolischer Lo sung Kristalle der Verbindung in Form feiner Nadeln zu kristallisieren. Die in Abb. 3-4 gezeigte ro ntgenographische Analyse der Verbindung besta tigt die Struktur. Mit 15 konnte auch ein verku rztes Analogon von 13 durch die direkte Reaktion von Methylaminoethanol mit NBDCl in sehr hoher Ausbeute gewonnen werden.
Abb. 3-4 | Ro ntgenkristallstruktur der Verbindung 13 | rot: O, blau: N, alle anderen: C, aus Gru nden der U bersichtlichkeit wurde H nicht abgebildet.
Die Reaktion von Intermediat 13 mit para-Toluensulfonsa uremethylester lieferte, im Gegensatz zu vorangegangenen Versuchen mit Iodmethan auch das korrespondierende quarterna re Ammoniumsalz 14. Eine weitere maskierte Ammoniumverbindung 16 wurde nach Alkylierung des tertia ren 2-N,N-Dimethylaminoethanols in guter Ausbeute isoliert. Die quarterna ren Verbindungen 14 und 16 kristallisierten nach beendeter Reak-tion in reiner Form aus, da sie praktisch unlo slich in organischen Lo sungsmitteln sind.
Dies erleichterte zwar ihre Isolation, es limitierte aber auch ihre weitere Verwendung in nicht-wa ssrigen Lo sungsmitteln.
Abb. 3-5 | Synthese eines geschu tzten Aminoethylphosphorodichloridats 18 nach HIRT und BERCHTOLD.[90]
Zur Vorbereitung der Phosphodiester-Bildung durch Phosphorodichloridat-Chemie wurde Intermediat 17 aus 2-Aminoethanol gewonnen, aus siedendem Toluen kristalli-siert und wie in Abb. 3-5 gezeigt zu Reagenz 18 umgesetzt.[90] Ohne Ausbeuteverluste erfolgte die Reaktion von 17 mit POCl3 auch in Toluen anstelle des in der Originalvor-schrift als Lo sungsmittel verwendeten Benzens. Durch Kristallisation aus wasserfreiem Diethylether wurde das Phosphorodichloridat 18 als farbloser Feststoff mit einer guten Ausbeute von 56% u ber zwei Stufen isoliert. NMR-Spektroskopie der Verbindung in CDCl3 zeigte korrespondierende Kopplungskonstanten JHP von etwa 10.5 Hz sowohl im 1H- als auch im 31P-NMR-Spektrum, die in einer Triplett-Aufspaltung des nicht Protonen-entkoppelten 31P-Signals bei 8 ppm resultierten (siehe Abb. 3-6). Die Abwesenheit weiterer Signale und Kopplungen belegt die von HIRT und BERCHTOLD vorgeschlagene Struktur.[90] Folglich konnte die erfolgreiche Bildung der phosphororganischen Verbindung 18 nachgewiesen und die erste Hu rde zur Synthese eines asymmetrischen Phosphodiesters genommen werden.
Abb. 3-6 | 31P-NMR-Spektrum von 18 und Vergro ßerung des diskutierten Signals (121 MHz, CDCl3).
3-1-2 | Fluoreszierende Fettsäure-Derivate
Wie in Abb. 3-7 gezeigt, wurde basierend auf Vorarbeiten[117,149] durch Nitrosylierung von 3-Diethylaminophenol und anschließende Kondensation des so gebildeten Phenols 19 mit einem Naphthol zuna chst das Nilrot-Derivat 20 in einer Ausbeute von 30% u ber zwei Stufen dargestellt.
Abb. 3-7 | Synthese von 2-Hydroxy-Nilrot 20 (NR-OH) nach [117,149].
Der Farbstoff 20 wurde im Anschluss mit 6-Bromhexansa uremethylester unter basischen Bedingungen alkyliert um 21 zu gewinnen (siehe Abb. 3-8).[119] Damit die anschließende Hydrolyse des Esters den Fluorophor intakt la sst, ist eine wasserfreie Methode unabding-bar. Darum dient Kaliumtrimethylsilanolat zur Hydrolyse des aufgrund seiner leichten
Verfu gbarkeit bisher meist verwendeten Methylesters 21.[119] Diese Methode erwies sich in der Praxis aber als langsam und unzuverla ssig, weshalb Alternativen untersucht wurden. Die Spaltung des Esters 21 mit wasserfreiem Lithiumiodid in siedendem Pyridin gelang, die Reaktionszeiten waren jedoch unbefriedigend. Eine Modifikation der Route fu hrte schließlich zum Erfolg, indem anstelle eines Methylesters der tert-Butylester 24 eingesetzt wurde, der durch Alkylierung von 20 mit dem eigens dargestellten Ester 23 in befriedigender Ausbeute erhalten werden konnte. 24 reagierte rasch und mit exzellenten Ausbeuten unter sauren Bedingungen zur gewu nschten markierten Hexansa ure 22.
Abb. 3-8 | Darstellung von mit Nilrot (NR) fluoreszent markierter Hexansa ure.
Ein MCC-markiertes Hexansa ure-Derivat 25 wurde in hoher Ausbeute von 91% in einem synthetischen Schritt durch Reaktion des ka uflich erha ltlichen Aktivesters MCC-OSu mit 6-Aminohexansa ure dargestellt (siehe Abb. 3-9). Zur Abtrennung von Nebenprodukten diente pra parative Du nnschichtchromatographie (DC).
Abb. 3-9 | Synthese von mit 7-Methoxycumarin-3-carboxylat (MCC) fluoreszent markierter Hexansa ure.
Wie in Abb. 3-10 gezeigt, wurden 22 und 25 im Anschluss unter STEGLICH-Bedingungen in die Aktivester 26 und 27 u berfu hrt. Aufgrund der ausgepra gten Hydrolyseempfindlich-keit der Verbindungen verminderte Sa ulenchromatographie die Ausbeuten in hohem Maße. Da bereits durch Extraktion mit wa ssrigen, leicht sauren Puffern ein Großteil der Nebenprodukte abgetrennt werden kann, wurde zugunsten der Ausbeute auf weitere Reinigungsschritte verzichtet und die erhaltenen Aktivester direkt weiter umgesetzt.
Abb. 3-10 | Aktivierung der fluoreszent markierten Hexansa ure-Derivate unter STEGLICH-Bedingungen.
Zusa tzlich zu fluoreszent markierten Fettsa uren erforderten die angestrebten Synthesen auch die Einfu hrung der nativen Fettsa uren Laurin- und Palmitinsa ure, die nach Literatur-vorschrift[150] zu diesem Zwecke ebenfalls in ihre Aktivester 28 und 29 u berfu hrt wurden.
3-1-3 | Stereoselektive Synthese von Sphingosin
Um den zentralen 2-(2S,3R)-Aminopent-4-en-1,3-diol-Baustein mit dem beno tigten Schutzgruppendekor als Ausgangsstoff fu r die angestrebte Olefinmetathese zu gewinnen, wurde zuna chst auf Arbeiten von GARNER und PARK[75,77] zuru ckgegriffen.
Abb. 3-11 | Synthese eines maskierten 2-(2S,3R)-Aminopent-4-en-1,3-diols, modifiziert nach [75,77].
Ausgehend von L-Serin wurde in 58% u ber vier Stufen Serinal 33 gebildet, der sogenannte GARNER-Aldehyd. Dessen GRIGNARD-Reaktion mit Vinylmagnesiumbromid bei tiefen Temperaturen lieferte aufgrund geringer Stereoselektivita t ein Diastereomeren-Gemisch des Allylalkohols 34 in moderater Ausbeute. Probleme bei der Trennung der Diastereomeren und die geringe Lagerfa higkeit der Verbindung infolge vielfa ltiger Umlagerungsmo glichkeiten machten es erforderlich, Alternativen heranzuziehen.
Abb. 3-12 | Stereoselektive Synthese eines geschu tzten Sphingosins nach [76,151,152].
Aufbauend auf Arbeiten von YAMAMOTO et al.,[76,153] gelang die Darstellung in ho herer Qualita t und Ausbeute, indem wie in Abb. 3-12 gezeigt, CC-Knu pfung und stereoselektive Reduktion voneinander getrennt wurden. Dazu wurde zuna chst u ber drei Stufen in exzellenter Ausbeute ein geschu tztes L-Serin-WEINREB-Amid 37 dargestellt, welches an-schließend einer GRIGNARD-Addition unterzogen wurde. Das so erhaltene MICHAEL -System 38 wurde anschließend mit Lithium-tri-tert-butoxyaluminumhydrid (TBLAH), stereoselektiv reduziert. Neben einer mo glichst konstant niedrigen Reaktionstemperatur von -84°C hatte die Wahl des Lo sungsmittels einen großen Einfluss auf das Gelingen der Reaktion. In einer sehr a hnlichen Reaktion wurde wasserfreier Ethylalkohol genutzt,[76]
allerdings lo st sich das Edukt 38 darin selbst 150°C u ber der Reaktionstemperatur kaum.
In Methanol hingegen laufen verschiedene Nebenreaktionen ab, die unter anderem den Silylether in Mitleidenschaft ziehen. Da die Stereoselektivita t der Reaktion in alkoho-lischen Lo sungsmitteln nach bisherigem Kenntnisstand am gro ßten ist,[76] wurde ein Ausweg gesucht, um die Reaktion in Ethylalkohol fu hren zu ko nnen. Dazu wurde 38 zuna chst in tr. Tetrahydrofuran (THF) gelo st und unter kra ftigem Ru hren mit der zehnfachen Menge tr. Ethylalkohols versetzt, wobei eine feine Suspension erhalten wurde,
die einer raschen Reduktion durch TBLAH zuga nglich war. Dieser Kompromiss gestattete die Gewinnung des gewu nschten Allylalkohols 39 in einer guten Ausbeute von 79%. Dabei waren Ausbeuteverluste weniger einer mangelnden Diastereoselektivita t, sondern viel-mehr einer U berreduktion des MICHAEL-Systems 38 zum korrespondierenden gesa ttigten Alkohol geschuldet. Dieses Nebenprodukt konnte aufgrund der großen chemischen A hnlichkeit zum Allylalkohol 39 erst in darauffolgenden Schritten vollsta ndig abgetrennt werden. Das Intermediat 39 wurde in insgesamt 56% Ausbeute u ber 5 Stufen isoliert.
Um das native Sphingosin-Ru ckgrat zu generieren, wurde der Allylalkohol 39 zusammen mit Pentadec-1-en in Anwesenheit von GRUBBS 2nd-Katalysator einer Olefinmetathese unterworfen. Dabei wurden moderate Ausbeuten erreicht, was zum Teil der bevorzugten Bildung des Homometatheseprodukts Octacos-14-en 43 geschuldet ist. Auch durch langsame Zugabe von Pentadec-1-en zur Reaktionsmischung konnten die Ausbeuten nicht gesteigert werden. Die Ausbeute von 40 verringerte sich durch die Bildung kleiner Mengen des unerwu nschten Z-Alkens Z-40, sowie der Ketone I-39 und I-40. Ein plausibler Mechanismusvorschlag der ihrer Bildung zugrundeliegenden Umlagerung ist in Abb. 3-13 wiedergegeben. A hnliche Fa lle sind aus der Literatur bekannt.[154,155]
Abb. 3-13 | Nach Olefinmetathese von 39 und Pentadec-1-en mit GRUBBS 2nd detektierte Produkte, sowie ein plausibler Mechanismus[154,155] der Bildung der Keton-Nebenprodukte | R = H oder C13H27.
Die Bildung der Keton-Nebenprodukte I-39 und I-40 wird besonders durch hohe Konzentrationen von Rutheniumhydrid-Spezies favorisiert.[154] Diese konnten zwar nicht durch die Zugabe von Benzochinon[154] unscha dlich gemacht werden, ihre Bildung konnte durch den Einsatz geringer Katalysatormengen jedoch vermindert werden. Auch die Inaktivierung des Katalysators nach beendeter Reaktion[156] half, die Bildung von Ketonen im Verlauf der Arbeiten erfolgreich zu minimieren und die Ausbeuten zu steigern.
Alternative Ansa tze, vor der Metathese die sekunda re Hydroxylgruppe zu maskieren, ergaben keine gesteigerte Effizienz der nachfolgenden Metathese. Dies liegt vermutlich daran, dass damit auch der gu nstige, die Reaktion beschleunigende, Effekt des Allylalkohols[154] verloren geht.
Durch Alkylierung mit (Chlormethyl)methylether (MOMCl) wurde die sekunda re, allylische Hydroxylgruppe von 40 maskiert und Verbindung 41 generiert um im weiteren Syntheseverlauf unerwu nschte Reaktionen des Alkohols auszuschließen. Der Pra kursor 41 diente als Plattform zur Installation von Phosphorylcholin-Analoga und/oder Fettsa urederivaten zur Synthese der FRET-Sonden (folgender Abschnitt), sowie der korrespondierenden Ceramide (siehe Kapitel 3-2).
Abb. 3-14 | 1H-NMR-Spektrum von 42 mit Vergro ßerung des Ausschnittes von 4.0-6.0 ppm (500 MHz).
Zur Vorbereitung der anschließenden Phosphorylierung wurde die prima re Hydroxyl-gruppe von 41 durch Desilylierung mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) freigelegt. So wurde das geschu tzte Sphingosin 42 in einer Ausbeute von 27% u ber 8 Stufen ausgehend von L-Serin erhalten. Das in Abb. 3-14 gezeigte 1H-NMR-Spektrum der Verbindung belegt die hohe Reinheit des Pra parates. In der Vergro ßerung sind bei 5.34 und 5.75 ppm ausschließlich die Signale der Olefin-Protonen des erwu nschten E-Isomers 42 zu er-kennen. Erwa hnenswert ist auch das Auftreten zweier Dublett-Signale der Methylen-Protonen der MOM-Gruppe aufgrund von Diastereotopizita t, die zusa tzlich einen merklichen Dach-Effekt zeigen. Zusa tzliche Signale anderer Diastereomere werden nicht beobachtet.
3-1-4 | Knüpfung des Phosphodiesters
Zur Knu pfung des asymmetrischen Phosphodiesters des angestrebten Sphingomyelin-Analogons wurden verschiedene Strategien erprobt. Diese Synthesen sind in Abb. 3-15 schematisch dargestellt.
Nachdem POCl3-basierte direkte Veresterungen nicht zum Ziel fu hrten, wurde zuna chst auf die im semibiosynthetischen Ansatz A erfolgreich verwendete H-Phosphonat-Chemie zuru ckgegriffen. Dazu sollte ein in Anlehnung an Literaturvorschriften[143] gewonnenes Ceramid 44 zuna chst in die korrespondierende H-Phosphonsa ure 45 u berfu hrt werden und diese im Anschluss mit dem Cholin-Pra kursor 12 zu 46 kondensiert werden. Beide Reaktionen ergaben das jeweilige Produkt in guten Ausbeuten. Interessanterweise erfolgten beide aufeinanderfolgenden Schritte unter Verwendung von NPCl (2-Chlor-5,5-dimethyl-1,3,2-dioxaphosphorinan-2-oxid).[91] Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Darstellung von H-Phosphonsa uren wie Phosphortrichlorid/Imidazol oder Salicylchlorophosphit (2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on) zeichnet dieses Reagenz sich dadurch aus, dass es ein leicht handhabbarer, wenig hydrolyseempfindlicher Feststoff ist. Zudem kann es auch anstelle von Pivaloylchlorid zur anschließenden Aktivierung der H-Phosphonsa ure dienen. Das dabei vermutlich gebildete intermedia re gemischte Phosphonsa ureanhydrid reagiert mit einem zugegebenen Alkohol zum H-Phosphonsa urediester.[91] Zur Oxidation dieses hydrolyseempfindlichen Zwischen-produkts wurde Tetrabutylammoniumperiodat verwendet, das in Vorversuchen zur Kupplung der Testverbindung Oleyl-H-phosphonat u berzeugende Resultate ergeben hatte.
Abb. 3-15 | Schema zur Synthese maskierter Sphingomyelin-Pra kursoren | von links nach rechts:
Darstellung mittels H-Phosphonat-, Phosphoramidit- oder Phosphorodichloridat-Methode, DIPEA = Diisopropylethylamin, NPCl = 2-Chlor-5,5-dimethyl-1,3,2-dioxaphosphorinan-2-oxid, Phth = ortho-Phthaloyl-.
Mittels Olefinmetathese sollte die so isolierte Verbindung 46 anschließend unter Verwendung entsprechender Alkene im Sphingosin-Ru ckgrat fluoreszent markiert werden. Der Phosphodiester 46 erwies sich dabei jedoch als nahezu inert. Vermutlich fu hrte das vorhandene tertia re Amin zur Desaktivierung des Ruthenium-Katalysators.
Dieser Effekt wurde auch durch NUSSBAUMER et al. bei Versuchen zum scrambling von Sphingolipiden mit NBD-markierten Olefinen beobachtet.[79] Zwar gelang die Markierung von Sphingomyelin in 5% Ausbeute, Sphingosin jedoch lieferte u berhaupt kein Produkt und N,N-Dimethylsphingosin nur nach Protonierung (die im Fall von 46 nicht mit den vorhandenen Schutzgruppen kompatibel ist). Um auszuschließen, dass nur die geringe Lo slichkeit der Edukte eine effektive Metathese verhindert, wurde die Reaktion in einem System aus Detergenz-haltigem, entgastem Wasser wiederholt, jedoch wurden auch so nur Spuren des angestrebten Produkts gebildet. Der Plan, einen Fluorophor im
Sphingosin-Ru ckgrat zu platzieren, wurde daraufhin endgu ltig verworfen. Infolgedessen wurde die eingangs (Seite 48 und folgende) bereits erla uterte Alternativstrategie entwickelt. In diesem Kontext sollten das im Kapitel 3-1-3 vorgestellte Sphingosin 42 und die NBD-markierten Phosphocholin-Derivate oder -Pra kursoren aus Kapitel 3-1-1 u ber einen Phosphodiester verknu pft werden. Versuche zur Phosphodiester-Synthese mittels H-Phosphonat-Methode unter Verwendung NBD-markierter Kopfgruppen-Analoga verliefen unbefriedigend. Die zur Kupplung erforderlichen oxidativen Bedingungen erwiesen sich als offenbar inkompatibel mit den vorhandenen funktionellen Gruppen der Nitrobenzoxadiazolylamin-Derivate. Dies a ußerte sich in der Bildung schwer zu trennender Stoffgemische und allgemein ungenu genden Ausbeuten. Darum wurde zur Verwendung Phosphoramidit-basierter Kupplungsreagenzien gewechselt, die LANKALAPALLI et al. im Jahre 2009 zur Synthese photoaktivierbarer Analoga von Ceramid-1-phosphat einsetzten.[157] Wie in Abb. 3-15 gezeigt, erwies sich das Reagenz 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorophosphoramidit in Kombination mit dem Phthalimid-maskierten Aminoethanol-Derivat 17 als tauglich zum Aufbau der ge-wu nschten Verbindung 49. Da ihre Verwendung aber ebenfalls mild oxidative Reaktions-bedingungen erfordert und nicht zuletzt mit erheblichen Kosten verbunden ist, wurde parallel ein geschu tztes Phosphorodichloridat 18 erprobt, welches bislang nur in wenigen Fa llen zur Darstellung von Kephalinen Verwendung fand.[90] Es erwies sich als Glu cksgriff, denn 18 ist in zwei Schritten aus gu nstigen Ausgangsverbindungen ohne Notwendigkeit einer Chromatographie erha ltlich. Seine Verwendung verringerte zusa tzlich die Anzahl der notwendigen linearen Syntheseschritte um zwei Stufen und verbesserte die Ausbeuten von 59 auf 89%. Mit der erfolgreichen Synthese des Phosphodiesters 49 konnte nun die abschließende Anbringung der Fluorophore erfolgen.
3-1-5 | Installation der Fluorophore
Nachdem die im vorangegangenen Abschnitt geschilderten Hu rden zur Knu pfung des asymmetrischen Phosphodiesters erfolgreich u berwunden wurden, schlossen sich relativ einfache Schritte zur finalen Darstellung der geplanten Sonde an.
Abb. 3-16 | Syntheseschema der finalen Installation der Fettsäuren zur Darstellung der angestrebten fluoreszent markierten Sphingomyelin-Analoga.
Wie in Abb. 3-16 gezeigt, lieferten die Hydrazinolyse des Phthalimids 49 nach der
Wie in Abb. 3-16 gezeigt, lieferten die Hydrazinolyse des Phthalimids 49 nach der