Suppressive Subtraktionshybridisierung (SSH) ist eine auf PCR basierende Methode, die häufig zur Isolierung differentiell exprimierter Gene, besonders solcher mit geringer Abundanz, eingesetzt wird (Diatchenko et al. 1996; Birch und Kamoun 2000). Speziell bei der Identifikation von Genen, die in Tumorgeweben im Vergleich zu gesundem Gewebe differentiell exprimiert werden, kommt SSH vielfach zum Einsatz (Yang et al. 1999;
Carvalho et al. 2002), so dass die Methode speziell für die Applikation im tierischen System optimiert wurde (Dr. S. Schmitz, BD Biosciences Clontech, pers. Mitteilung). SSH findet aber auch bei der Analyse genomischer Unterschiede zwischen Bakterienstämmen und der Isolierung differentiell exprimierter Pflanzengene Verwendung (Janke et al. 2001). So wurde diese Methode unter anderem in Tomate, Kartoffel, Arabidopsis, Reis und Gerste angewendet, um differentiell exprimierte Gene nach Pathogenbefall, Seneszenzeintritt chemischer Induktion oder abiotischem Stress zu identifizieren (Birch et al. 1999; Beyer et al.
2001; Hinderhofer und Zentgraf 2001; Liu et al. 2001; Werner et al. 2001; Xiong et al. 2001;
Jarosch 2002).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden vier Suppressive Subtraktionshybridisierungen durchgeführt. In allen vier Hybridisierungen wurde SMARTTM-cDNA, die aus PolyA+-RNA hergestellt worden war, als Ausgangsmaterial eingesetzt. Die SMARTTM-Technologie ermöglicht es, auch aus geringen Mengen an RNA, große Mengen cDNA herzustellen, da die Methode eine Amplifizierung der cDNA über PCR einschließt (Spirin et al. 1999). In mehreren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass bei einer geringen Anzahl an Zyklen in der PCR, das Verhältnis der einzelnen Transkripte zueinander verglichen mit der Ausgangs-RNA unverändert blieb (Herrler 2000; Vernon et al. 2000; Zhumbayaeva et al. 2001). Diese Beobachtung konnte in der vorliegenden Arbeit mit Poly 4-2 (Aktin) bestätigt werden, dessen Expression nach Inokulation sowohl über SMARTTM-RT-PCR als auch über Northern überprüft wurde. In beiden Fällen konnte die schwache Induktion des Gens nach Pathogenbefall bestätigt werden (vgl. Abb. 3.11 und 8.7)
In den ersten beiden SSHs, in denen Gerstengene isoliert werden sollten, die nach Inokulation Mlg-spezifisch verstärkt exprimiert waren, zeigten insgesamt 59 Fragmente, die 35 unterschiedliche Gene repräsentierten, differentielle Signale auf den Reversed Northern Dot Blots. Mittels Northern-Analysen oder SMARTTM-RT-PCR wurde versucht, die differentielle Expression für 25 dieser Gene zu bestätigen. Nur eines der Gene, Pl074 (ohne signifikante
Homologie), zeigte im Northern eine stärkere Expression in Mlg-tragenden Linien im Vergleich zu suszeptiblen Linien nach Inokulation (s. 3.4.1). Dieser Unterschied in der Expression trat allerdings erst ab 16 hpi auf, also zu einem Zeitpunkt, der bei der SSH nicht berücksichtigt wurde, da hier die Expression 11-13 hpi untersucht worden war. Somit war das Auffinden dieses differentiell exprimierten Gens bei den SSHs eher zufällig, so wie das der anderen 4 Mehltaupilz-induzierten Gene (Pl006, Pl016, Pl073, Pl075), bei denen kein linienspezifischer Unterschied in der Expression zu detektieren war. Bei der dritten SSH sollten konstitutiv differentiell exprimierte Gene der Mlg-tragenden Linie isoliert werden. Für keines der 5 Gene, die in den Reversed Northern Dot-Blots differentielle Signale zeigten und anschließend in Northern-Analysen oder SMARTTM-RT-PCR untersucht wurden, konnte allerdings eine stärkere Expression in der Mlg-tragenden Linie im Vergleich zur suszeptiblen bestätigt werden.
In der letzten SSH, die der Isolation pathogeninduzierter Gene dienen sollte, zeigten 12 Gene differentielle Signale in den Reversed Northern Dot-Blots, von denen nur eines, Pl121 (WIR1B-Homolog), mittels SMARTTM-RT-PCR als pathogeninduziert bestätigt werden konnte.
Die Gründe für den auf den ersten Blick nur wenig erfolgreichen Verlauf der SSHs können sehr vielfältig sein, da viele Kriterien bei der Anreicherung differentiell exprimierter Gene über SSH eine Rolle spielen.
Als Erklärung dafür, dass bei den ersten 3 SSHs keine Gene isoliert wurden, die in der Mlg-tragenden Linie IWe im Vergleich zur suszeptiblen Linie Ingrid stärker exprimiert waren, kann angenommen werden, dass es solche Gene nicht gab. Es ist denkbar, dass weder konstitutiv noch zu einem frühen Zeitpunkt (3-13 hpi) der Gerste/Bgh-Interaktion die Expression eines Gens in den beiden Linien unterschiedlich stark war. Bei vergleichenden Genexpressionsstudien in den ersten 24 Stunden der Interaktion mit Bgh konnten zwischen Mla1- und mla1-tragenden Gerstenlinien ebenfalls keine Unterschiede nachgewiesen werden (Davidson et al. 1988; Gregersen et al. 1997). Das gleiche fanden Clark und Mitarbeiter in mlo- und Mlo-Gerstenlinien in den ersten 15 Stunden der Interaktion mit dem Echten Gerstenmehltaupilz (Clark et al. 1993). Auch PR-Gene, wie die von Peroxidasen und Chitinasen, zeigten erst ab 30 hpi erste Unterschiede in ihrer Expression zwischen der resistenten und der anfälligen Linie (Boyd et al. 1994).
Ebenso wie in den SSHs konnte auch in einem parallel zu dieser Arbeit durchgeführten cDNA-AFLP kein Gen isoliert werden, das in den Mlg-tragenden Linien IWe und MiGf im
waren (Eckey in Vorbereitung). Da im cDNA-AFLP nahezu alle Gene auf ihre Expression hin untersucht worden sind, kann man sagen, dass es wahrscheinlich keine Gene gab, die konstitutiv oder zu frühen Zeitpunkten der Interaktion mit Gerstenmehltaupilz deutlich differentiell zwischen Mlg- und mlg-tragenden Linien exprimiert waren.
Das erklärt aber nicht das Ergebnis der vierten SSH, bei der Bgh-induzierte Gene angereichert werden sollten. In dem bereits erwähnten cDNA-AFLP waren ca. 4 % der dargestellten Genfragmente pathogenresponsiv, die meisten zeigten eine verstärkte Expression nach Inokulation mit Gerstenmehltaupilz (Eckey in Vorbereitung), so dass auch bei der SSH mehr als eines der 14 untersuchten Gene mehltaupilz-induziert hätte sein sollen.
Doch bei den meisten der in den Reversed Northern Dot Blots differentiellen Klone handelte es sich um Falsch-Positive. Das Auftreten dieser Fragmente, die sich dadurch auszeichnen, dass sie in den Reversed Northern Dot-Blots differentielle Signale zeigen, ihre differentielle Expression allerdings nicht in Northern Analysen oder über RT-PCR bestätigt werden kann, ist ein häufiges Problem der SSH. Aus diesem Grund wurde bereits eine Methode, die sogenannte mirror orientation selection (MOS), die die Eliminierung Falsch-Positiver aus der SSH-Bank erlauben soll, entwickelt (Rebrikov et al. 2000).
Die Entstehung solcher Falsch-Positiven während der SSH kann verschiedene Ursachen haben. Diatchenko et al. vor einer Präamplifikation des Ausgangsmaterials, da sich dadurch der Anteil Falsch-Positiver in der resultierenden SSH-Bank erhöhen könnte, so dass die Amplifikation der cDNA in der SMARTTM-PCR möglicherweise das Auftreten falsch-positiver Signale verstärkt hat (Diatchenko et al. 1999). Der Anteil Falsch-Positiver nimmt auch zu je weniger differentielle mRNAs in der Hybridisierung vorhanden sind, d.h. je weniger homogen das Ausgangsmaterial ist (Diatchenko et al. 1999; Desai et al. 2000). Desai et al. (2000) konnten zeigen, dass bei einer SSH, die dem Auffinden differentiell exprimierter Gene in Prostatatumoren dienen sollte, nur 3 % der Klone der SSH-Bank tatsächlich differentiell exprimiert waren, während es bei einem vergleichbaren Experiment mit Hirntumoren 70 % waren. Der Grund für diesen Unterschied lag nach Meinung der Autoren darin, dass Prostatatumore nur zu etwa 30 % tumoröses Material enthalten, während Hirntumore oft zu 100 % aus Krebszellen bestehen. Ein inokuliertes Gerstenprimärblatt kann in gewisser Weise in Bezug auf seine Homogenität mit dem Gewebe eines Prostatatumors verglichen werden. In einem Ansatz, in dem man cDNA von pathogeninfiziertem Material als Tester und cDNA von nicht-infiziertem als Driver verwendet, ist der Anteil differentieller mRNAs vergleichsweise niedrig, da nur etwa 16 % der Gene in den ersten 24 Stunden einer Pathogenattacke in ihrer Expression verändert werden (Scheideler et al. 2002). Besonders zu
frühen Zeitpunkten der Gerste/Bgh-Interaktion reagieren nicht alle Zellen des Gerstenblattes auf die Pathogenattacke, so dass die Expression pathogenresponsiver Gene speziell im Mesophyll noch nicht vollständig induziert ist, und Transkripte differentiell exprimierter Gene nur in einem Teil der Zellen zu finden sind.
Zudem wurden die Suppression-PCRs in der vorliegenden Arbeit mit einem bzw. 5 Zyklen mehr durchgeführt, als vom Hersteller empfohlen, was ebenfalls das Auftreten Falsch-Positi-ver begünstigt haben könnte (Diatchenko et al., 1999). Die Erhöhung der Zyklenzahl schien notwendig, da bei geringerer Amplifikation keine Produkte nach gelelektrophoretischer Trennung sichtbar waren.
Die geringe Ausbeute an Bgh-induzierten Genen in der vierten SSH kann aber auch darin begründet sein, dass die Hybridisierung nicht erfolgreich verlaufen ist. Die Effektivität der Subtraktion hängt stark von der Effizienz ab, mit der die beiden Adaptoren zuvor an die Tester-cDNA-Fragmente ligiert wurden (Desai et al. 2000). Diese Ligationseffizienz war in der vierten SSH geringer als vom Hersteller gefordert und konnte auch durch experimentelle Variationen nicht gesteigert werden, so dass möglicherweise die Hybridisierung nicht erfolgreich verlaufen ist.
Über die Effizienz von SSH in anderen Arbeiten mit Pflanzenmaterial kann nur wenig gesagt werden, da oft keine Aussagen darüber getroffen wurden, wie viele der im ersten Screening differentiell erschienenen cDNAs in unabhängigen Analysen bestätigt werden konnten. Birch und Mitarbeiter konnten in einer SSH mit Kartoffelpflanzen zeigen, dass 10 % der Klone der SSH-Bank tatsächlich im Sinne der Fragestellung des Versuchs differentiell exprimiert waren (Birch et al. 1999). Xiong et al. (2001) konnten 4,4 % der Klone aus einer Reis-SSH-Bank als durch M. grisea induziert bestätigen. Bei Beyer et al. (2001) entsprachen nur 1,4 % der Klone der SSH-Bank der ursprünglichen Fragestellung. In der Dissertation von Birgit Jarosch, die SSH angewendet hatte, um DCINA-induzierte Gene der Gerste zu isolieren, waren 2,0 % der über SSH angereicherten cDNAs tatsächlich differentiell exprimiert (Jarosch 2002). Man muss feststellen, dass es nur wenigen Arbeitsgruppen gelungen ist, mittels SSH eine Anreicherung von differentiell exprimierten Genen zu erreichen.