Table 6.1: Crystallographic Table
Data Collectiona SpCascade -I-Fv (SeMet) SpCascade-I-Fv-R-Loop
Space group I2 P 3221
Cell dim ensions
a, b, and c (Å) 157.002 143.316
- 65.894 143.316
- 160.682 172.698
α, β, and γ (°) 90.00 90.00
- 98.61 90.00
- 90.00 120.00
Energy (Å) 0.979 0.991
Resolution (Å) 47.97 - 3.00 45.27 - 3.25
- (3.10 - 3.00) (3.36 - 3.25)
Rmerge 0.0547 (0.356) 0.168 (1.922)
I / σI 13.18 (2.05) 11.66 (1.80)
Completeness (%) 100.0 (100.0) 100.0 (100.0)
Redundancy 10.0 (9.8) 11.1 (11.4)
CC(1/2) 0.99 (0.72) 0.99 (0.85)
Anomalous completeness (%) 99.5 (99.8) -
Anomalous redundancy 5.2 (5.3) -
Refinem ent
Resolution (Å) 49.28 - 3.00 46.91 - 3.25
No. reflections 32,875 (3,271) 32,783 (3,192)
Rwork/ Rfree 19.4 21.8
- 24.9 27.7
No. atoms 11,803 13,131
Macromolecule 11,803 13,131
Ligand 0 0
Water 0 0
R.m.s deviations - -
Bond lengths (Å) 0.015 0.010
Bond angles (°) 1.34 1.29
Ramachandran (%) - -
Preferred 95.93 96.76
Allow ed 3.92 3.1
Outliers 0.15 0.14
aStatistics for the highest-resolution shell are shown in parentheses.
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Supplementary Figure 1: Comparison of the short type I-Fv and type I-E Cascade. Left: The ca rtoon s hows the crys tal s tructure of the type I-Fv Ca scade complex from S. putrefaciens CN32 i n two different orientations. The crRNA, Ca s6f, the three Cas7fv protei ns and Cas5fv a re shown in orange, green, blue and red, respectively. The 3′ a nd 5′ ends of the crRNA are i ndicated.
Dotted lines i ndicate the wrist helix a nd palm/phumb helix formed by Ca s7fv.1-3/Cas5fv. Right: Ca rtoon of the R-loop/type I-E Ca s ca de from E. col i. The Cas7e.1-6, Ca s6e, Cas5e, Cs e1 (Cas8e) a nd Cs e2.1-2 are in l ight blue, green, red, yellow a nd darkblue, res pectively. The crRNA i s represented a s orange cartoon/surface. Target and non-target DNA are s hown as light-green ca rtoon/surface. The coordinates are derived from PDB-ID: 5H9A, Fi gure from Pa usch et al., 2017.
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Supplementary Figure 2: LacZ-repeat RNA extraction. RNA wa s extracted from va rious samples of the Ni -NTA puri fi ca ti on of Ca s proteins a nd repeat-tagged RNA. Extra cted RNA was separated by a garose gel electrophoresis i n whi ch 2-l og DNA l a dder (M) wa s l oa ded for s i ze reference.
Supplementary Figure 3: TEM analysis of filaments from lacZ-Repeat.
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Supplementary Figure 4: 2D class averaging model of filaments structures from TEM analysis (see Figure 2.18).
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Supplementary Figure 5: TEM analysis of first half of the peak (fraction of 13ml elution volume) after size-exclusion of MonoQ purification.
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Supplementary Figure 6: TEM analysis of MonoQ purification sample (fraction of 13 ml elution volume during salt gradient).
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Supplementary Figure 7: FACS analysis of E. coli expressing cas genes as well as either the control or the repeat-tagged construct overnight at 18 °C after induction. Fl uores cence wa s mea s ured i n rel a ti ve fl uores cence uni ts (RFU). Cel l s not producing s fGFP a t all (-) s howed no fl uores cence a t a l l a nd a control expres s i ng onl y sfgfp (C) s howed the ma xi mum fl uores cence.
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Abgrenzung der Eigenleistung
Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse wurden von mir selbstständig ohne andere als die hier aufgeführte Hilfe durchgeführt. Im Folgenden werden weitere an dieser Arbeit beteiligten Personen sowie deren experimentellen Beiträge genannt:
Dr. Patrick Pausch:
Hat im Rahmen seiner Promotion, die Kristallstruktur von I-Fv Cascade und der Cas7fv Helix gelöst und die dazugehörigen Abbildungen erstellt (Figure 2.4 -2.7 und Supplementary Figure 1). Zusätzlich hat er das Cas3fv-Konstrukt kloniert und die Expressionsbedingungen für Cas3fv optimiert.
Dr. Thomas Heimerl:
Hat als Kollaborationspartner die elektronenmikroskopische n Aufnahmen der Filamente und der synthetischen Cascade-Varianten erstellt, sowie die Modelle durch 2D Class averaging erzeugt.
Julia Wiegel:
Hat die Fluoreszenzmikroskopie-Experimente für sfGFP-Silencing durchgeführt.
Hamrithaa Shanmuganathan:
Hat im Rahmen ihres Forschungspraktikums das sfGFP-Cas7fv Fusions-Konstrukt kloniert und im Rahmen ihrer Masterarbeit die FACS-Experimente für sfGFP-Silencing durchgeführt.
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Danksagung
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Lennart Randau für die Möglichkeit diese Doktorarbeit in seinem Labor durchzuführen, aber auch für die ständige Gesprächsbereitschaft, konsequente Beratung und den stetigen Enthusiasmus an meiner Arbeit.
Herzlicher Dank gilt meinem Thesis Advisory Committee, bestehend aus Prof. Dr. Gert Bange und Prof.
Dr. Anke Becker für die hilfreichen Ratschläge und Anregungen während meiner Promotion. Zusätzlicher Dank geht an Prof. Dr. Bange für die Zweitkorrektur dieser Arbeit. Dem gesamten Komitee sowie Prof.
Dr. Tobias Erb ist außerdem für die Teilnahme an meiner Prüfungskommission zu danken.
Ein elementarer Bestandteil dieser Arbeit war die Kooperation mit der Arbeitsgruppe Bange der Phillips-Universität Marburg, wofür ich nochmal Prof. Dr. Bange danken möchte . Besonderer Dank gilt hier Dr. Patrick Pausch, der nicht nur für die Kristall-Strukturen in dieser Arbeit verantwortlich ist, sondern mir auch stets mit gutem Rat und für wissenschaftliche Diskussionen zur Verfügung stand. Dank gilt ebenso seinem Nachfolger in diesem Projekt, Nils Mais, für Unterstützung und Rat nach Patricks Abschluss. Dr. Thomas Heimerl ist für sämtliche elektronenmikroskopische Aufnahmen und den daraus resultierenden Modellen zu danken, aber auch für die freundliche Beratung. Ohne diese Kooperation wäre diese Arbeit, in dieser Form nicht möglich gewesen.
Bei meiner Graduiertenschule IMPRS bedanke ich mich für diverse Förderung und für die Leitung durch die Promotion im Allgemeinen.
Zudem möchte ich mich bei der gesamten Arbeitsgruppe Randau für die gute Atmosphäre und die stetige Unterstützung bedanken. Dies gilt sowohl für alle derzeitigen als auch ehemaligen Mitglieder.
Wichtig sind hierbei auch die ehemaligen Studenten, die ich betreut habe: Shivabalan Arun Prabha, Eva Grümpel und Hamrithaa Shanmuganathan. Sie haben einen wichtigen Beitrag für diese Arbeit geleistet und mich die Betreuung von Studenten gelehrt. Danken möchte ich aber auch meinem ehemaligen Betreuer Dr. Srivatsa Dwarakanath, der die Untersuchung des Typ I-Fv Systems etabliert hat.
Zuletzt möchte ich noch all meinen Freunden, meiner Familie und meiner Verlobten Iryna Salii danken, mit deren Unterstützung ich auch schwierige Zeiten überstehen konnte und ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.