Summary
Single ribosomal proteins are required for specific steps in eukaryotic ribosome biogenesis.
Consequently, depletion of a certain r-protein leads to a block or delay in pre-rRNA maturation and/or transport of precursor subunits. However, the exact molecular functions of the r-proteins in these processes are still obscure. To accurately investigate the molecular functions and to determine possible multiple roles, variant r-proteins with partial functionality were created and their impact on ribosome biogenesis was analyzed.
One set of variant r-proteins was created based on the conservation of r-proteins between the evolutionary kingdoms. In this approach, archaeal r-proteins were expressed in yeast and assayed for conserved functions. The functional characterization of archaeal ribosomal proteins showed the ability of many of them to assemble in vivo into eukaryotic pre-ribosomes. This suggests that r-protein – rRNA interactions are widely conserved between Archaea and Eukarya. Interestingly, incorporation of two archaeal r-proteins into nascent ribosomal subunits promoted their subsequent nuclear export. Apparently, the role of the homologous eukaryotic r-protein in nucleo-cytoplasmic transport is based on evolutionary conserved features and not due to a gain of function in the course of evolution.
In an alternative approach, variant r-proteins were created based on current atomic structure models of eukaryotic small subunits, possibly giving insights into structure-function correlation of certain r-proteins. Thorough analysis of rpS5, the primary binder of the head domain revealed a dual role in ribosome biogenesis: A first one in the global organization of the SSU head domain. And a second one in establishment of a highly defined spatial arrangement in the head-platform interface of nascent SSUs that is required for efficient processing of the 18S rRNA 3'-end. This interface most probably senses the overall maturation/assembly state of the head domain of pre-SSUs. Thereby, many phenotypes caused by depletion of other head domain r-proteins can be explained.
Furthermore, functional characterization of several variants of rpS2, rpS14 and rpS20 indicated that final cytoplasmic 3'-end processing of eukaryotic 18S rRNA not only depends on a certain protein composition of small ribosomal subunit precursors, but also on their exact conformational state. RNA co-immunoprecipitation experiments and mass spectrometric analyses showed that the sole assembly of the putative nuclease, mediating the final maturation step of SSU precursors, is not sufficient to trigger removal of pre -rRNA sequences. The occurrence of this processing step is therefore consequence of a highly defined assembly and folding state of nascent small ribosomal subunits and might directly correlate with their capability to function in translation.
Summary – Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einzelne ribosomale Proteine werden für spezifische Schritte in der Ribosomen Biogenese von Eukaryonten benötigt. Demzufolge führt das Fehlen eines bestimmten ribosomalen Proteins zur Verzögerung bzw. Verhinderung von Vorläufer rRNA Reifungschritten und/oder dem Transport von Vorläufer Partikeln. Bis jetzt sind die genauen molekularen Funktionen der ribosomalen Proteine jedoch noch größtenteils unbekannt. Um diese genauer zu untersuchen und eventuelle, zusätzliche Funktionen aufzudecken, wurden veränderte ribosomale Proteine mit nur partieller Funktion hergestellt und der daraus resultierende Einfluss auf die Ribosomen Biogenese untersucht.
Ein Satz von veränderten ribosomalen Proteinen wurde basierend auf der Konservierung einiger ribosomaler Proteine in den evolutionären Königreichen hergestellt. Hierzu wurden die archaeellen ribosomalen Proteine in S. cerevisiae exprimiert und auf konservierte Funktionen hin untersucht. Durch funktionelle Charakterisierung von archaeellen ribosomalen Proteinen konnte gezeigt werden, dass diese in vivo in Vorläufer Ribosomen eingebaut werden. Dies deutet darauf hin, dass die grundlegenden Interaktionen von ribosomalen Proteinen und ribosomaler RNA weitgehend konserviert sind. Interessanterweise war dieser Einbau in zwei Fällen ausreichend, um den Kernexport von Vorläufer Ribosomen zu unterstützen. Offensichtlich ist die Funktion des entsprechenden eukaryontischen ribosomalen Proteins im Kernexport auf evolutionär konservierte Merkmale zurückzuführen und nicht auf erworbene Fähigkeiten im Laufe der Evolution.
In einem parallelen Ansatz wurden Varianten ribosomaler Proteine basierend auf aktuellen Strukturmodellen erstellt. Dies sollte Hinweise auf Struktur-Funktion Korrelation bestimmter ribosomaler Protein geben. Detaillierte Analyse von rpS5, dem primären Binder der Kopfdomäne, zeigte eine doppelte Rolle dieses Proteins in der Ribosomen Biogenese: Zum einen, in der generellen Organisation der Kopfdomäne der kleinen Untereinheit. Zum anderen, in der Etablierung einer hochgradig definierten räumlichen Anordnung des Kopfdomänen-Plattform Bereichs, der für den effizienten Ablauf des letzten Reifungsschritts der 18S rRNA benötigt wird. Veränderungen im Reifungs-, oder Assemblierungszustand der Kopfdomäne von Vorläufer Untereinheiten könnten folglich zu einer Störung der Anordnung dieses Bereichs führen. Durch diesen Mechanismus lassen sich viele der Phänotypen erklären, die durch Fehlen eines ribosomalen Proteins der Kopfdomäne entstehen.
Weiterhin gab die funktionelle Charakterisierung von Varianten der ribosomalen Proteine rpS2, rpS14, und rpS20 Hinweise darauf, dass die endgültige Reifung der 18S rRNA im Zytoplasma nicht nur von einer bestimmten Protein Zusammensetzung, sondern auch von der exakten dreidimensionalen Form der Vorläufer Ribosomen abhängt. RNA Ko-Immunpräzipitationen und Analysen durch Massenspektrometrie zeigten, dass die Anwesenheit der mutmaßlichen Nuklease, die den letzten Reifungsschritt in der Biogenese 104
der kleinen Untereinheit katalysiert, alleine nicht ausreichend ist, um den Reifungsschritt ablaufen zu lassen. Das Ablaufen dieses letzten Reifungsschrittes ist daher Konsequenz eines im hohen Maße definierten Assemblierungs- und Faltungszustands der Vorläufer Partikel. Zusätzlich könnte diese Reifung die Grundlage der vollen Funktionalität von kleinen ribosomalen Untereinheiten in der Translation sein.
Materials & Methods