5.1 English version
The penetration barrier of mammalian skin resides in its outermost skin layer, the SC. Since the intercellular SC lipid matrix was recognized to represent the major pathway for drug penetration, this remarkable lamellar structure has increasingly at-tracted interest during recent years. Oriented SC lipid membranes of simplistic com-position as studied in this thesis were shown to represent ideal models resembling the structural conditions of the SC lipid lamellae despite their simplicity. The present work addressed the issue of elucidating the way different lipid species modify the morphology of SC lipid model bilayers. Different methodological approaches were applied such as neutron diffraction combined with deuterium labelling for the study of the molecular bilayer structure, and DSC and FT Raman spectroscopy for the inves-tigation of the thermotropic phase behaviour of the lipids. The experimental findings were confirmed using additional techniques like 2H NMR spectroscopy and MD simu-lations. The phytosphingosine-type CER[NP] was shown to induce the formation of an exceptional lamellar architecture in a ternary SC lipid model membrane. This structure is characterized by the occurrence of phase separation, an extremely low interlamellar hydration deviating from the behaviour of the likewise phytosphingosine-based CER[AP], and an outstanding lamellar stability even under thermal stress. The SC lipids were shown to be in a true liquid-crystalline and highly ordered state, clear-ly exceeding the degree of chain order detected in presence of CER[AP]. Conse-quently, the phytosphingosine-based ceramide subclasses are concluded to be of utmost importance for the stability of the SC lipid bilayer assembly. Next, the equiva-lence of an artificial CER[EOS] with a branched and saturated ω-acyl chain (“CER[EOS]_branched”) and its natural pendant was verified. DSC and FT Raman spectroscopy proved the phase behaviour of CER[EOS]_branched to be comparable to its naturally occurring pendant CER[EOS]. Moreover, the investigated model membranes containing either the artificial or the natural CER[EOS] species besides CER[AP], CHOL and BA exhibited the same bilayer architecture. The assumption that the saturated ω-acyl chain in CER[EOS]_branched might exceed the stabilizing forces of the polar CER[AP] and induce the formation of the LPP was not corroborat-ed. CER[AP] remained to be the driving force for the lamellar lipid arrangement and constrained all other components to fit into the short bilayer structure. For that
pur-pose the long-chain CER[EOS]_branched either spans the long acyl chain through the whole membrane into the adjacent bilayer unit cell, or surprisingly integrates in-side one unit cell by folding back the ω-acyl moiety and bending at the carboxyl group. The latter arrangement was revealed by MD simulations and might also apply for CER[EOS]. These findings also underline the protruding role of the phytosphingo-sine-type ceramides obviously exceeding the impact of the long-chain ω-acyl ceramide species.
In the second part the modes of action of the lipophilic penetration enhancers OA and IPM on the basis of the quaternary model membrane containing CER[AP], CHOL, PA and ChS were verified. For the unsaturated fatty acid OA a significant per-turbation of lamellar order of the SC lipid model bilayers was detected. This was at-tributed to the bended structure of the cis unsaturated enhancer molecules. The posi-tion of the enhancer was determined using the specifically deuterated compound.
Since phase separation was not observed, the bilayer disordering effects were con-cluded to constitute the major mode of enhancer activity of OA. On the contrary, the branched ester IPM induces phase separation. A specifically deuterated compound was again used for proving the presence of IPM in both coexisting phases and for determination of its exact position. In one of the coexisting phases IPM is accommo-dated in a surprising arrangement: in addition to the expected assembly of IPM with its ester group anchored in the bilayer head group region and the myristoyl chain stretched to the bilayer center, a second fraction of IPM is completely immersed in the hydrophobic area of the SC lipid bilayers with the tetradecanoyl moiety stretched through the central region into the other bilayer leaflet. Based on the present experi-mental findings, IPM´s mode of action is predominantly founded on induction of phase separation and the likewise observed bilayer perturbation.
To conclude, the present work verified the mode of action of two penetration enhancers on a molecular scale by means of neutron diffraction. In addition, the im-pact of two different ceramide subclasses on the lamellar architecture of simplistic SC lipid model systems was investigated. The latter were proven to be the appropri-ate tool to determine the relevance of single SC lipid species for the bilayer stability.
Moreover, the present thesis highlights the benefit offered by using multidisciplinary
5.2 German version
Die Penetrationsbarriere der menschlichen Haut wird von deren äußerster Schicht, dem Stratum corneum gebildet. Die außergewöhnliche lamellare Struktur seiner interzellulären Lipidmatrix stellt die Hauptroute für penetrierende Stoffe dar und hat in den letzten Jahren außerordentliches Interesse ausgelöst. Orientierte Lip-idmembranen mit einfacher Zusammensetzung, wie sie in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, stellen trotz ihrer Einfachheit ausgezeichnete Modelle zur Abbil-dung der strukturellen Besonderheiten der Lipiddoppelschichten des Stratum corne-um dar. Die vorliegende Arbeit widmete sich der Fragestellung, auf welche Art und Weise verschiedene Lipidspezies die Nanostruktur von Stratum corneum-Lipiddoppelschichten modifizieren. Dazu wurden mehrere Methoden genutzt, wie zum Beispiel die Neutronenstreuung zusammen mit spezifischer Deuterium-Markierung für die Strukturaufklärung der molekularen Bilayerstruktur, und DSC so-wie FT-Raman-Spektroskopie zur Untersuchung des thermotropen Phasenverhal-tens der Lipide. Die experimentellen Befunde wurden durch zusätzliche Techniken wie Deuterium-NMR-Spektroskopie und Molecular Dynamcis (MD) Simulationen ab-gesichert und bestätigt.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Phytosphingosin-basierte Ceramid NP die Ausbildung einer außergewöhnlichen lamellaren Struktur in einer ternären Stratum corneum-Lipidmodellmembran bewirkt. Diese Struktur zeich-net sich durch das Auftreten von Phasenseparierungen, eine für Ceramid AP nicht beschriebene marginale interlamellare Hydratisierung, sowie eine besondere Stabili-tät der Doppelschichten auch unter thermischer Belastung aus. Es stellte sich her-aus, dass sich die Lipide in einem flüssigkristallinen Zustand befinden, und dass der lamellare Ordnungsgrad im Ceramid NP-basierten System deutlich höher ist als im Ceramid AP-basierten Modell. Es wurde geschlussfolgert, dass die Phytosphingosin-Ceramidklassen eine besondere Bedeutung für die Stabilität der Stratum corneum-Lipiddoppelschichten haben. Im nächsten Schritt wurde die Äquivalenz eines artifizi-ellen Ceramid EOS-Abkömmlings mit gesättigter und verzweigter ω-Acyl-Seitenkette (CER[EOS]_branched) und des natürlichen Ceramid EOS bewiesen. Messungen mittels DSC und FT-Raman-Spektroskopie zeigten ein vergleichbares thermotropes Phasenverhalten der beiden Verbindungen. Darüber hinaus wurde für Modellmemb-ranen jeweils bestehend aus Ceramid EOS oder Ceramid EOS_branched in Verbin-dung mit Ceramid AP, Cholesterol und Behensäure die gleiche Membranstruktur
er-mittelt. Die Vermutung, dass durch die gesättigte ω–ständige Seitenkette der nicht natürlich vorkommenden Substanz Ceramid EOS_branched die stabilisierenden Kräfte des polaren Ceramid AP unter Bildung einer LPP unterbunden werden kön-nen, wurde nicht bestätigt. Ceramid AP bleibt die entscheidende Triebkraft, welche die anderen Lipide dazu zwingt, sich in einer kurzen lamellaren Phase anzuordnen.
Dabei streckt das künstliche Ceramid EOS_branched seine lange Seitenkette durch die Einheitszelle bis in die benachbarte Doppelschicht, oder es integriert sich interes-santerweise durch ein Umknicken an der Estergruppe und entsprechendes Zurück-falten der ω-Acyl-Seitenkette in die ursprüngliche Doppelschicht. Diese molekulare Anordnung wurde mittels MD Simulationen gefunden und ist gleichermaßen denkbar für das natürlich vorkommende Ceramid EOS. Auch diese Ergebnisse stellen die besondere Bedeutung der Phytosphingosin-Ceramidklassen heraus, welche den Ein-fluss der langkettigen ω-Acylceramide deutlich übertreffen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Wirkmechanismus der lipophilen Penetra-tionsenhancer OA und IPM anhand einer quaternären Modellmembran basierend auf Ceramid AP, Cholesterol, Palmitinsäure und Cholesterolsulfat untersucht. Für die ungesättigte Fettsäure OA wurde eine erhebliche Störung der lamellaren Ordnung innerhalb der Lipiddoppelschichten detektiert, was der gekrümmten Struktur der cis-konfigurierten ungesättigten Enhancermoleküle zugeschrieben werden kann. Mittels der spezifisch deuterierten Ölsäure-Spezies OA-d2 konnte die exakte Position des Enhancers bestimmt werden. Phasenseparierungen wurden nicht beobachtet und es wurde geschlussfolgert, dass das Auslösen lamellarer Unordnung den Hauptwir-kungsmechanismus des Penetrationsenhancers OA darstellt. Im Gegensatz dazu bewirkt die verzweigtkettige Struktur des flüssigen synthetischen Wachses IPM das Auftreten von Phasenseparierungen. Mittels der spezifisch deuterierten Spezies IPM-d3 wurde der Beweis erbracht, dass die Enhancermoleküle in beiden lamellaren Pha-sen zugegen sind. Darüber hinaus wurde auch hier die exakte Position des Penetra-tionsenhancers bestimmt. In einer der beiden nebeneinander vorliegenden Phasen ist IPM in ungewöhnlicher Weise angeordnet: zusätzlich zur erwarteten Position, bei der IPM mit seiner Estergruppe im hydrophilen Kopfgruppenbereich der Stratum cor-neum-Lipiddoppelschicht verankert ist und die Myristoylseitenkette zur Bilayermitte
über die Bilayermitte hinaus in die andere Hälfte der Doppelschicht. Eine Störung des lamellaren Ordnungszustandes wurde in den experimentellen Ergebnissen für IPM ebenfalls beobachtet, was hier in Kombination mit der Erzwingung von Pha-senseparation als Hauptmechanismus der Wirkung des synthetischen Wachses IPM als Penetrationsenhancer angesehen wurde.
Abschließend lässt sich sagen, dass im Rahmen der vorliegenden Arbeit die molekularen Wirkmechanismen von zwei Penetrationsenhancer-Spezies mittels Neutronenstreuung aufgeklärt wurden. Darüber hinaus wurde der Einfluss zweier Ceramidsubklassen auf die Morphologie einfacher Stratum corneum-Lipidmodellysteme untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass solche orientierten Systeme einen idealen Ansatz darstellen, um die Bedeutung einzelner Stratum cor-neum-Lipidspezies für die Stabilität der lamellaren Strukturen zu bestimmen. Darüber hinaus wird durch die vorliegende Arbeit hervorgehoben, dass ein multidisziplinärer Ansatz basierend auf der Kombination mehrerer Methoden von entscheidendem Vor-teil für die Strukturuntersuchung von Stratum corneum-Lipidmodellmembranen ist.