1 Einleitung
3.2 Voruntersuchungen für die [ 35 S]GTPγS-Bindungsexperimente
3.3.2 Einfluss der Testsubstanzen auf die ACh-induzierte
3.3.2.3 Strychnin und Derivate
3.3.2.3 Strychnin und Derivate
-50 0 50 100 150
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
-∞
10 0 100 300 1000 3000 Strychnin (µM)
ACh (log M) ACh-induzierte [35 S]GTPγS-Bindung (%)
Abbildung 38: Einfluss steigender Konzentrationen von Strychnin auf die ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve. Ordinate: ACh-induzierte [35S]GTPγS-Bindung in Prozent [Basalaktivität (unteres Plateau der Kontrollkurve) = 0%, ACh-Maximaleffekt (oberes Plateau der Kontrollkurve) = 100%].
Abszisse: Dekadischer Logarithmus der molaren Konzentration von ACh. Kurvenanpassung:
„Vier-Parameter-logistische-Gleichung“ (Gleichung 6); Hill-Koeffizient konstant: nH = 0,76.
Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler aus 3-4 unabhängigen Experimenten (Kontrollkurve: n
= 17) in Vierfachbestimmung, wobei jeweils ein Strychnin- und ein Kontroll-Experiment gemeinsam durchgeführt wurden.
Kontrolle Strychnin 10 µM
Strychnin 100 µM
Strychnin 300 µM
Strychnin 1000 µM
Strychnin 3000 µM 7,87 7,58 6,98 6,07 5,41 4,92 pEC50
± 0,06 ± 0,09 ± 0,11** ± 0,20** ± 0,14** ± 0,10**
Max(%) 102 ± 2 108 ± 3 91 ± 3* 104 ± 6 85 ± 4** 67 ± 3**
Min (%) -2 ± 2 -8 ± 3 1 ± 3 2 ± 4 -3 ± 2 -13 ± 2
0,83 0,59 0,59 0,89 0,61 1,03
nH
(frei-laufend) ± 0,09 ± 0,08# ± 0,08# ± 0,32 ± 0,13 ± 0,12
n 17 4 4 3 3 3 Tabelle 28: Kenngrößen (± Standardfehler resultierend aus der Kurvenanpassung) der gemittelten ACh-Konzentrations-Effekt-Kurven aus Abbildung 38 unter Kontrollbedingungen sowie unter Einfluss steigender Konzentrationen von Strychnin. pEC50, Max und Min beruhen auf einer Kurvenanpassung mit nH = 0,76.
pEC50: negativer dekadischer Logarithmus der ACh-Konzentration, die eine halbmaximale [35S]GTPγS-Bindung induziert.
Max: maximale [35S]GTPγS-Bindung (oberes Plateau der Konzentrations-Effekt-Kurve).
Min: minimale [35S]GTPγS-Bindung (unteres Plateau der Konzentrations-Effekt-Kurve).
nH (freilaufend): freilaufender Hill-Koeffizient.
n: Anzahl der unabhängigen Experimente.
*/** signifikante Abweichung vom Kontrollwert (Dunnett t-Test, p < 0,05/0,01).
# signifikant bessere Kurvenanpassung mit freilaufendem Hill-Koeffizienten als mit nH = 1 (F-Test, p
< 0,05).
Die bereits von Lazareno und Birdsall (1995) in [35S]GTPγS-Experimenten beobachtete Senkung des ACh-Maximaleffektes durch Strychnin deutete auf einen nicht-kompetitiven Antagonismus hin. Deshalb wurden die Daten nach dem allosterischen Modell (Lanzafame et al., 1996) analysiert (Abbildung 39). Die Affinität von Strychnin zum freien M2-Rezeptor wurde beschrieben durch einen pKA-Wert von 5,15 ± 0,13. In [3H]NMS-Bindungsexperimenten wurden pKA-Werte von 4,96 (Lazareno und Birdsall; 1995), 4,93 (Jakubík et al., 1997), 4,56 (Jakubík et al.; 2005), und 5,47 (Proška und Tuček; 1996) für die Affinität von Strychnin zum unbesetzten M2-Rezeptor gefunden. Die letzten beiden Werte unterschieden sich signifikant vom Ergebnis dieser Arbeit, jedoch nicht um mehr als eine Dekade, so dass insgesamt eine gute Übereinstimmung mit den Literaturwerten bestand. Ein pα–Wert, der auf die Bildung ternärer Komplexe hinwies, konnte nicht ermittelt werden, da die Verschiebungsfaktoren keinem Maximalwert zustrebten.
Der Kooperativitätsfaktor konnte nur mit pα < -3 abgeschätzt werden. Bei Auswertung der Daten mittels linearer Regression (Gerade in Abbildung 39 nicht dargestellt) nahm die Steigung ungewöhnlicherweise mit s = 1,26 ± 0,10 einen signifikant größeren Wert als 1 an (F-Test, p < 0,05).
-6 -5 -4 -3 -2 -1 -1
0 1 2 3
4 pα < -3
pKA(Strych.)= 5,15 ± 0,13
Strychnin (log M)
log (VF-1)
Abbildung 39: Schild-Auftragung der Strychnin-induzierten Rechtsverschiebung der ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve. Ordinate: Dekadischer Logarithmus der Differenz aus dem jeweiligen Verschiebungsfaktor (VF) und 1. Abszisse: Dekadischer Logarithmus der molaren Konzentration von Strychnin. Kurvenanpassung: Gleichung 17 (basierend auf den pEC50-Werten der Einzelexperimente; Steigungsmaß der einzelnen Konzentrations-Effekt-Kurven: nH = 0,76).
Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler aus 3-4 unabhängigen Experimenten in Vierfach-bestimmung.
Es wurde versucht den senkenden Einfluss von Strychnin auf den ACh-Maximaleffekt zu quantifizieren. Da die Max-Werte aus Tabelle 28 nicht zusammenhängend, sondern an verschiedenen Versuchstagen bestimmt wurden, wurden drei unabhängige Experimente mit jeweiliger Vierfachbestimmung durchgeführt, in denen zu einer konstanten, rezeptorsättigenden ACh-Konzentration (1mM) steigende Strychnin-ACh-Konzentrationen hinzugegeben wurden.
Die gemittelten Messwerte dieser Experimente stellen die geschlossenen Symbole in Abbildung 40 dar. Die Max-Werte aus Tabelle 28, an die keine Kurvenanpassung erfolgte, sind zusätzlich als offene Symbole abgebildet. Die Daten der geschlossenen Symbole wurden mithilfe der „Vier-Parameter-logistischen-Gleichung“ angepasst. Die Hill-Steigung war nicht signifikant verschieden von nH = -1 (freilaufender Hill-Koeffizient: nH = -1,41 ± 0,86). Als pIC50
(Wendepunkt der Kurve) ergab sich ein Wert von 3,59 ± 0,24. Das untere Plateau der Kurve wurde beschrieben durch Emin = 75 ± 3%. Da sich in Abbildung 39 keine Sättigung der Rechtsverschiebung der ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve zeigte, ist
es wahrscheinlich, dass die Senkung des Maximaleffektes nicht auf der Bildung ternärer Komplexe beruhte.
Auch Lazareno und Birdsall (1995) fanden in [35S]GTPγS-Bindungsexperimenten an M2-Rezeptoren eine Reduktion des ACh-Maximaleffektes bei Strychnin-Konzentrationen ab 100 µM. In ihren Untersuchungen wurde jedoch zusätzlich die basale [35S]GTPγS-Bindung signifikant gesenkt. Die ACh-Konzentrations-Effekt-Kurven wurden durch Strychnin nach rechts verschoben. Ebenfalls durchgeführte Radioligandbindungsstudien mit [3H]NMS (Lazareno und Birdsall, 1995) zeigten, dass Strychnin allosterisch mit muskarinischen Rezeptoren interagierte.
0 50 100 150
-7 -6 -5 -4 -3 -2
-∞
Strychnin (log M) ACh-induzierte [35 S]GTPγS-Bindung (%)
Abbildung 40: Einfluss steigender Konzentrationen von Strychnin auf den ACh-induzierten Maximaleffekt (ACh: 1 mM). Ordinate: ACh-induzierte [35S]GTPγS-Bindung in Prozent [Basalaktivität = 0%, ACh-Maximaleffekt (oberes Plateau der Kurve) = 100%]. Abszisse:
Dekadischer Logarithmus der molaren Konzentration von Strychnin. Kurvenanpassung: „Vier-Parameter-logistische-Gleichung“ (Gleichung 6); Hill-Koeffizient konstant: nH = -1. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler aus 3 unabhängigen Experimenten (geschlossene Symbole). Die Datenpunkte mit offenen Symbolen zeigen die Max-Werte aus Abbildung 38 bzw. Tabelle 28.
3.3.2.3.2 Di-Strychnin-6
Zlotos et al. (2003) beobachteten in Radioligandbindungsstudien eine Erhöhung der Gleichgewichtsbindung von [3H]NMS sowie eine [3 H]NMS-Dissoziationsverzögerung vom M2-Rezeptor durch Di-Strychnin-6, was als ein deutlicher Hinweis für eine allosterische Interaktion gilt (Lazareno et al., 2000). 10 µM Di-Strychnin-6 riefen bereits eine signifikante Rechtsverschiebung der ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve hervor (Abbildung 41). Für die Zusammenschau der
Versuchsergebnisse konnte anhand der Methode nach Lew und Angus (1995; s.
2.4.4) durch einen F-Test gezeigt werden, dass die Gesamtheit der Versuchsergebnisse ausreichend mit Kurven vom Steigungsmaß nH = 1 beschrieben waren verglichen mit einem freilaufenden, individuellen Steigungsmaß für jede Konzentrations-Effekt-Kurve. Somit handelte es sich um eine Parallelverschiebung der Kurven. Die höchste eingesetzte Di-Strychnin-6-Konzentration (100 µM) führte zu einer signifikanten Steigerung des ACh-induzierten Maximaleffektes auf 115 ± 5% (Dunnett t-Test, p < 0,05). Die basale [35S]GTPγS-Bindung wurde nur in einer mittleren Di-Strychnin-6-Konzentration (30 µM) signifikant gesenkt (Dunnett t-Test, p < 0,01).
-50 0 50 100 150
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
-∞
1 0 3 10 30 100
Di-Strychnin-6 (µM)
ACh (log M) ACh-induzierte [35 S]GTPγS-Bindung (%)
Abbildung 41: Einfluss steigender Konzentrationen von Di-Strychnin-6 auf die ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve. Ordinate: ACh-induzierte [35S]GTPγS-Bindung in Prozent [Basalaktivität (unteres Plateau der Kontrollkurve) = 0%, ACh-Maximaleffekt (oberes Plateau der Kontrollkurve) = 100%]. Abszisse: Dekadischer Logarithmus der molaren Konzentration von ACh.
Kurvenanpassung: „Vier-Parameter-logistische-Gleichung“ (Gleichung 6); Hill-Koeffizient konstant: nH = 1. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler aus 2-4 unabhängigen Experimenten (Kontrollkurve: n = 12) in Vierfachbestimmung, wobei jeweils ein Di-Strychnin-6- und ein Kontroll-Experiment gemeinsam durchgeführt wurden.
Kontrolle Di-
Strychnin-6 1 µM
Di-
Strychnin-6 3 µM
Di-
Strychnin-6 10 µM
Di-
Strychnin-6 30 µM
Di-
Strychnin-6 100 µM 7,60 7,37 7,27 6,86 6,49 5,92 pEC50
± 0,06 ± 0,06 ± 0,12 ± 0,07** ± 0,10** ± 0,12**
Max(%) 99 ± 2 101 ± 2 94 ± 5 97 ± 2 102 ± 4 115 ± 5*
Min (%) 1 ± 2 -7 ± 3 -10 ± 4 2 ± 3 -17 ± 4** -3 ± 5
0,75 0,95 0,90 1,19 0,69 0,73
nH
(frei-laufend) ± 0,06# ± 0,13 ± 0,23 ± 0,21 ± 0,11 ± 0,17
n 16 4 4 3 2 3
Tabelle 29: Kenngrößen (± Standardfehler resultierend aus der Kurvenanpassung) der gemittelten ACh-Konzentrations-Effekt-Kurven aus Abbildung 41 unter Kontrollbedingungen sowie unter Einfluss steigender Konzentrationen von Di-Strychnin-6. pEC50, Max und Min beruhen auf einer Kurvenanpassung mit nH = 1.
pEC50: negativer dekadischer Logarithmus der ACh-Konzentration, die eine halbmaximale [35S]GTPγS-Bindung induziert.
Max: maximale [35S]GTPγS-Bindung (oberes Plateau der Konzentrations-Effekt-Kurve).
Min: minimale [35S]GTPγS-Bindung (unteres Plateau der Konzentrations-Effekt-Kurve).
nH (freilaufend): freilaufender Hill-Koeffizient.
n: Anzahl der unabhängigen Experimente.
*/** signifikante Abweichung vom Kontrollwert (Dunnett t-Test, p < 0,05/0,01).
# signifikant bessere Kurvenanpassung mit freilaufendem Hill-Koeffizienten (F-Test, p < 0,05).
In der Schild-Auftragung (Abbildung 42) erfolgte eine Auswertung der Daten nach Lanzafame et al. (1996), da ein allosterisches Verhalten von Di-Strychnin-6 am M2-Rezeptor festgestellt werden konnte (Zlotos et al., 2003). Der pKA-Wert betrug 5,61 ± 0,11. Da die Verschiebungsfaktoren im untersuchten Konzentrationsbereich keinem Maximalwert zustrebten, konnte der Kooperativitätsfaktor nur mit pα < -2 abgeschätzt werden. Höhere Konzentrationen an Di-Strychnin-6 konnten aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit der Substanz nicht untersucht werden.
-7 -6 -5 -4 -3 -1
0 1 2
3 pα < -2
pKA(Di-Strych.)= 5,73 ± 0,12
Di-Strychnin-6 (log M)
log (VF-1)
Abbildung 42: Schild-Auftragung der Di-Strychnin-6-induzierten Rechtsverschiebung der ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve. Ordinate: Dekadischer Logarithmus der Differenz aus dem jeweiligen Verschiebungsfaktor (VF) und 1. Abszisse: Dekadischer Logarithmus der molaren Konzentration von Di-Strychnin-6. Kurvenanpassung: Gleichung 17 (basierend auf den pEC50-Werten der Einzelexperimente; Steigungsmaß der einzelnen Konzentrations-Effekt-Kurven: nH = 1). Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler aus 2-4 unabhängigen Experimenten in Vierfachbestimmung.
3.3.2.3.3 Str6Naph
Str6Naph ist ein Hybrid aus Strychnin und einer Teilstruktur von Naphmethonium.
Sowohl die Naphthalimid-Struktur von Naphmethonium als auch der Strychnin-Rest sind Molekülteile, die zu einer hohen Affinität am M2-Rezeptor führen (Muth et al., 2005; Zlotos et al., 2003). Dancila (2003) fand in [3 H]NMS-Bindungsexperimenten eine hohe Affinität von Str6Naph zum NMS-besetzten Rezeptor (pEC50, diss = 7,81 ± 0,04). Die Affinität zum freien M2-Rezeptor war relativ niedrig (pKA = 6,07 ± 0,37), so dass die durch Str6Naph hervorgerufene Steigerung der NMS-Affinität außergewöhnlich hoch war. Die Konzentrations-Effekt-Kurven von Str6Naph in den Radioligandbindungsstudien wiesen außerdem eine hohe Steilheit auf, die auf ein atypisches Bindungsverhalten hinwies (Dancila, 2003).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Str6Naph auf die ACh-induzierte [35S]GTPγS-Bindung untersucht. Str6Naph verhielt sich in allen eingesetzten Konzentrationen (ab 1 µM) antagonistisch gegenüber ACh, so dass die
ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve nach rechts verschoben wurde (Abbildung 43). Es handelte sich um eine Parallelverschiebung mit einer Steigung von nH = 1 (Test auf Parallelverschiebung: s. 2.4.4). 100 µM Str6Naph führten zu einer signifikanten Steigerung des ACh-Maximaleffektes (Dunnett t-Test; p < 0,01) auf 156 ± 7%. Die spontane [35S]GTPγS-Bindung wurde durch einige Str6Naph-Konzentrationen signifikant, jedoch nicht konzentrationsabhängig herabgesetzt.
-50 0 50 100 150 200
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
-∞
0,1 0 1 3 10 30 100 Str6Naph (µM)
ACh (log M) ACh-induzierte [35 S]GTPγS-Bindung (%)
Abbildung 43: Einfluss steigender Konzentrationen von Str6Naph auf die ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve. Ordinate: ACh-induzierte [35S]GTPγS-Bindung in Prozent [Basalaktivität (unteres Plateau der Kontrollkurve) = 0%, ACh-Maximaleffekt (oberes Plateau der Kontrollkurve) = 100%].
Abszisse: Dekadischer Logarithmus der molaren Konzentration von ACh. Kurvenanpassung:
„Vier-Parameter-logistische-Gleichung“ (Gleichung 6); Hill-Koeffizient konstant: nH = 1. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler aus 2-3 unabhängigen Experimenten (Kontrollkurve: n = 17) in Vierfachbestimmung, wobei jeweils ein Str6Naph- und ein Kontroll-Experiment gemeinsam durchgeführt wurden.
Kontrolle Str6- Naph 0,1 µM
Str6-Naph 1 µM
Str6-Naph 3 µM
Str6-Naph 10 µM
Str6-Naph 30 µM
Str6-Naph 100 µM 7,59 6,71 5,96 5,23 5,48 5,15 4,87 pEC50
± 0,04 ± 0,08** ± 0,15** ± 0,14** ± 0,05** ± 0,10** ± 0,08**
Max(%) 99 ± 1 112 ± 4 98 ± 7 94 ± 6 86 ± 2* 109 ± 5 156 ± 7**
Min (%) 1 ± 2 -10 ± 3 -21 ± 6** 2 ± 4 -30 ± 2** 1 ± 3 -16 ± 5**
0,85 0,95 0,75 0,88 0,96 1,06 1,00
nH
(frei-laufend) ± 0,07 ± 0,18 ± 0,25 ± 0,27 ± 0,12 ± 0,22 ± 0,19
n 17 3 3 3 3 2 3 Tabelle 30: Kenngrößen (± Standardfehler resultierend aus der Kurvenanpassung) der gemittelten ACh-Konzentrations-Effekt-Kurven aus Abbildung 43 unter Kontrollbedingungen sowie unter Einfluss steigender Konzentrationen von Str6Naph. pEC50, Max und Min beruhen auf einer Kurvenanpassung mit nH = 1.
pEC50: negativer dekadischer Logarithmus der ACh-Konzentration, die eine halbmaximale [35S]GTPγS-Bindung induziert.
Max: maximale [35S]GTPγS-Bindung (oberes Plateau der Konzentrations-Effekt-Kurve).
Min: minimale [35S]GTPγS-Bindung (unteres Plateau der Konzentrations-Effekt-Kurve).
nH (freilaufend): freilaufender Hill-Koeffizient.
n: Anzahl der unabhängigen Experimente.
*/** signifikante Abweichung vom Kontrollwert (Dunnett t-Test, p < 0,05/0,01).
In einer Auftragung nach Lanzafame et al. (1996; Abbildung 44) zeigte die abflachende Kurve, dass es in Anwesenheit von Str6Naph zur Bildung ternärer Komplexe kam. Es ergab sich eine Affinität von Str6Naph zum freien Rezeptor von pKA = 7,69 ± 0,11 und ein Kooperativitätsfaktor von pα = -2,69 ± 0,14. Daraus ließ sich die Affinität von Str6Naph zum ACh-besetzten Rezeptor berechnen mit p(α·KA) = 5,00.
-8 -7 -6 -5 -4 -3 0
1 2 3 4
5 pα = -2,69 ± 0,14
pKA(Str6Naph)= 7,69 ± 0,11
Str6Naph (log M)
log (VF-1)
Abbildung 44: Schild-Auftragung der Str6Naph-induzierten Rechtsverschiebung der ACh-Konzentrations-Effekt-Kurve. Ordinate: Dekadischer Logarithmus der Differenz aus dem jeweiligen Verschiebungsfaktor (VF) und 1. Abszisse: Dekadischer Logarithmus der molaren Konzentration von Str6Naph. Kurvenanpassung: Gleichung 17 (basierend auf den pEC50-Werten aus Tabelle 30). Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler aus 2-3 unabhängigen Experimenten in Vierfach-bestimmung.
3.3.2.4 Alcuronium und Caracurine