Struktur und Bindung

Auf molekularer Ebene ist der 5-HT₃-Rezeptor ein Liganden-gesteuerter Ionenkanal [50], der strukturell stark mit anderen Rezeptoren der „Cys-loop“-Superfamilie verwandt ist [51, 52]. So ist der 5-HT3-Rezeptor ein Pentamer bestehend aus fünf cyclisch um eine Pore angeordneten Untereinheiten (vgl. Abb. 1-6).

Abb. 1-6: Quartärstruktur des 5-HT3-Rezeptors nach [53]

Desweiteren besitzen die Untereinheiten eine große extrazelluläre N-terminale Domäne. Diese bildet eine charakteristische Schleife durch eine Disulfid-Brücke, welche von zwei Cystein-Bausteinen mit einem Abstand von 15 Aminosäuren gebildet wird. Wahrscheinlich ist die Bindungsstelle für Liganden hier lokalisiert. Durch Modelling-Experimente mit Hilfe der Kristallstruktur des Acetylcholin-bindenden Proteins (AChBP) konnte THOMPSON et al. eine mögliche Bindungsstelle für Liganden postulieren [46, 54]. Dabei wird die Bindungsstelle von drei α-Helices der einen Untereinheit und drei β-Ketten einer zweiten Untereinheit gebildet (vgl. Abb. 1-7).

Abb. 1-7: Mögliche Liganden-Bindungsstelle des 5-HT3-Rezeptors mit α-Helices einer Untereinheit (A-C) und den ergänzenden β-Ketten einer zweiten Untereinheit (D-F) [54]

Die transmembranäre Domäne jeder Untereinheit besteht aus vier hydrophoben α-Helices (TM1-TM4), wovon die Transmembrandomänen TM3 und TM4 über eine größere intrazelluläre Schleife verbunden sind (vgl. Abb. 1-8) [55, 56]. Diese Schleife besitzt Bindungsstellen für die Tyrosinkinase und die Proteinkinase A [2] und beeinflusst die Funktion des Kanalproteins [57].

Abb. 1-8: Tertiärstruktur einer Untereinheit des 5-HT3-Rezeptors nach [2, 58]

An der Bildung der Porenstruktur ist vor allem die Transmembrandomäne 2 (TM2) und sehr wahrscheinlich auch ein Teil der Transmembrandomäne 1 (TM1) beteiligt [2] (vgl.

Abb. 1-9).

Abb. 1-9: Quartärstruktur eines 5-HT3-Rezeptors (Aufsicht) [46]

Die α-Helix der Transmembrandomäne 2 bildet eine für Wasser zugängliche Pore und darunter einen hydrophoben Knick, der als Schleuse dient [59, 60]. Bei Ligandenbindung kommt es zu einer Umlagerung eines Prolins von trans nach cis in der Schleife zwischen TM2 und TM3 und damit zur Kanalöffnung [61] (vgl. Abb. 1-10).

Abb. 1-10: Untereinheit der 5-HT3-Rezeptors: Möglicher Mechanismus der Kanalöffnung nach [61]

Das Pro 8* (blau) fungiert als Gelenk für die Bewegung der Transmembrandomäne M2 (grün), dabei wird der durch Leu 9‘ (gelb) geschlossene Kanal geöffnet.

Der genaue Mechanismus der molekularen Aktivierung ist aber bis dato noch nicht vollständig geklärt. Man weiß allerdings, dass für die Aktivierung in vivo zwei oder mehr Moleküle Serotonin nötig sind.

Die intrazelluläre Domäne wird von den Schleifen zwischen TM1 und TM2 bzw. TM3 und TM4 gebildet. Eine genaue Struktur ist noch nicht bekannt, aber besonders die große Schleife zwischen TM3 und TM4 scheint Einfluss auf die Ionenleitfähigkeit des Rezeptors zu haben [47, 62]. Der homopentamere Rezeptor 5-HT_3A besitzt nur geringe Leitfähigkeit. Zusammen mit der Untereinheit 5-HT3B, die allein keinen Rezeptor bilden kann, wird die Leitfähigkeit des heteropentameren Rezeptors stark erhöht. Das könnte an drei Arginin-Molekülen in der Schleife zwischen TM3 und TM4 liegen, welche bei der 5-HT_3A-Untereinheit fehlen.

Derzeit kennt man fünf verschiedene Untereinheiten des 5-HT₃-Rezeptors (5-HT_3A-E), wovon zwei näher beschrieben sind. Im Jahre 1991 gelang MARIQ et al. die Klonierung der aus 487 Aminosäuren bestehenden 5-HT_3A-Untereinheit aus dem Neuronalgewebe der Maus (1995 aus Humangewebe) [56]. Die Sequenz ähnelt der anderer Ionenkanäle. Die klonierte 5-HT3A-Untereinheit kann heterolog, z.B. in HEK 293-Zellen oder Xenopus-Oocyten, exprimiert werden. Aus dieser Untereinheit können funktionelle homopentamere Rezeptoren gebildet werden, wie sie wahrscheinlich im ZNS vorkommen. Diese weisen jedoch einige funktionelle Unterschiede zu nativen Rezeptoren auf. So war beispielsweise die Einzelkanal-Gesamt-Leitfähigkeit der homopentameren Rezeptoren im Sub-Picosiemens-Bereich, während bei nativen Rezeptoren eine Leitfähigkeit von 9-17 pS gemessen wurden [62-64]. Auch in der Leitfähigkeit gegenüber Ca²⁺-Ionen wurden Unterschiede festgestellt [63, 65, 66] und so vermutete VAN HOOFT , dass noch ein zusätzlicher Faktor oder eine weitere Untereinheit für die Funktion nötig ist [67].

Im Jahre 1999 gelang es DAVIES et al. [47] und DUBIN et al. [68] unabhängig voneinander, diese zweite Untereinheit (5-HT3B) aus menschlichem Gewebe zu klonen und im Jahre 2000 wurde sie von HANNA et al. auch aus Neuronalgewebe der Maus gewonnen [69]. Allerdings sind die 5-HT3B-Untereinheiten nicht in der Lage ein funktionelles homopentameres Kanalprotein zu bilden. Ein Grund dafür könnte sein, dass die Untereinheit 5-HT3B eine veränderte TM2-Region besitzt [47]. In Koexpression mit der 5-HT_3A-Untereinheit bilden sich heteropentamere Kanalproteine (5-HT_3AB -Rezeptor), die sich zwar pharmakologisch nur wenig von homopentameren Rezeptoren unterscheiden [70], jedoch biophysikalisch starke Unterschiede aufweisen, wie erhöhte Einzelkanal-Gesamt-Leitfähigkeit oder die geringe Leitfähigkeit von Ca²⁺ [47]. Durch rasterkraftmikroskopische Untersuchungen (Atomic force microscopy) konnte BARRERA et al. [71] im Jahr 2005 eine Anordnung B-B-A-B-A im heteropentameren 5-HT_3AB-Rezeptor aufzeigen. Ob dies der nativen Anordnung entspricht ist immer noch

unklar, da bei diesen Experimenten die Primärstruktur der exprimierten Rezeptoren verändert wurde.

Aufgrund von Affinitätsunterschieden zu Liganden und Unterschieden in der Einzelkanalleitfähigkeit in verschiedenen Geweben und Zelllinien kam man zur Hypothese, dass es noch weitere Varianten geben muss. Dies wurde durch verschiedene Western Blot Experimente bestätigt [58, 62, 64].

Im Jahr 2003 konnten zwei Arbeitsgruppen unabhängig voneinander die Existenz von Genen für mindestens drei weitere Untereinheiten nachweisen [48, 72]. Diese Untereinheiten haben viele Gemeinsamkeiten mit der 5-HT_3A- und 5-HT_3B-Untereinheit [55] wie vier Transmembrandomänen oder die große intrazelluläre Schleife [57]. Wie bereits erwähnt wird die Kanalpore von den Transmembrandomänen 2 (vgl. Abb. 1-9) der fünf Untereinheiten gebildet. Diese leicht polare Domäne wird von drei negativ geladenen Ringen umgeben und ist verantwortlich für den Ionenstrom. Bei den Transmembrandomänen 2 der Untereinheiten 5-HT3B, 5-HT3C, 5-HT3D und 5-HT3E fehlt diese polare Komponente [48]. Diese können zusammen mit der Untereinheit 5-HT_3A heteropentamere Rezeptoren bilden.

Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist aber noch nicht bewiesen, ob die Untereinheiten 5-HT_3C-E im nativen Organismus gebildet werden. Die Vielfalt der Kombinationsmöglichkeiten würde allerdings die Unterschiede in verschiedenen Geweben erklären [48].

Die funktionelle Vielfältigkeit des 5-HT3-Rezeptors wird durch verschiedene Abwandlungen zusätzlich erhöht. So kennt man von der 5-HT_3A-Untereinheit zwei verschiedene Splice-Varianten [73]. Zusätzlich können die Rezeptoren an verschiedenen Stellen glykosyliert [44, 47, 74-76] oder phosphoryliert [56, 67, 77-79]

werden, was die Vielfältigkeit weiter erhöht.