Steady-state Enzymkinetiken

Zur funktionellen Charakterisierung von HisH und HisF wurden enzymkinetische Messungen unter steady-state Bedingungen bei RT durchgeführt und die katalytischen Parameter KMund kcat bestimmt. Es wurde die Komplexreaktion (glutamin-abhängige Reaktion, Abbildung A) zur Bestimmung des KM für PRFAR unter Sättigung mit Glutamin, die HisF-Teilreaktion (ammoniumabhängige Reaktion, Abbildung B) zur Bestimmung des KMPRFAR

unter Sättigung mit Ammoniumsalzen und die HisH-Teilreaktion (Glutaminase-Reaktion, Abbildung C) zur Bestimmung des KM für Gln unter Sättigung mit PRFAR gemessen. Alle Messungen wurden mit komplexierten Proteinen durchgeführt.

Abbildung 4.4: Schematische Dars tellung der glutaminabhängigen Komplexreaktion (a), der ammoniumabhängigen HisF-Teilreaktion (b), sowie der Glutaminase-HisH-Teilreaktion (c).

Farbkodierung: HisF (blau), HisH (orange), aktive Zentren (rot).

(a) (b)

(c)

Methoden 72 4.4.11.1 Messung der glutaminabhängigen Gesamtreaktion

Die glutaminabhängige Reaktion ist die physiologische Gesamtreaktion. Glutamin wird von HisH zu Glutamat und NH3 hydrolisiert. NH3 wird durch den hydrophoben Kanal zu HisF transferiert und dort mit dem Substrat PRFAR in ImGP und AICAR umgesetzt.

Da PRFAR sehr labil ist, wurde es in situ aus dem stabileren ProFAR mittels HisA hergestellt (Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001). HisA wurde im Überschuss zugesetzt (600nM) und die Reaktion nach einigen Minuten durch Zugabe des HisH:HisF Komplexes bzw. der Varianten gestartet. Die Reaktion wurde über den Abfall der Absorption bei 300nm verfolgt und quantifiziert (∆ε300 (ProFAR – AICAR) = 5,64 mM^-1cm^-1, Klem & Davisson, 1993).

Damit die Hydrolyse von Glutamin durch HisH die einzige Ammoniak-Quelle in der Reaktion ist, wurde Ammonium- freier Tris Acetat Puffer pH 8,0 und Ammonium- freies ProFAR verwendet. Es wurden unter Sättigung mit Glutamin und PRFAR gesamte Umsatzkurven aufgenommen und durch Fit mit der integrierten Michaelis-Menten-Gleichung (COSY, Eberhard, 1990) die katalytischen Parameter KMPRFAR

und Vmax bzw. kcat bestimmt.

Zusätzlich wurden unter Sättigung mit Glutamin und unterschiedlichen PRFAR-Konzentrationen Anfangssteigungen und daraus Sättigungskurven erstellt. Daraus wurde wiederum KMPRFAR

und Vmax bzw. kcat ermittelt. Die wichtigsten Versuchsbedingungen für wildtypisches HisH:HisF im Überblick:

4.4.11.2 Messung der ammoniumabhängigen HisF-Teilreaktion

Die ammoniumabhängige Reaktion ist die von HisF katalysierte Teilreaktion, wobei Ammoniumsalze als Quelle für NH3 dienen. Analog zur glutaminabhängigen Reaktion wird das Substrat PRFAR in situ aus dem stabileren ProFAR mittels HisA hergestellt (Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001). HisA wurde im Überschuss zugesetzt (600nM) und die Reaktion

5mM Glutamin (sättigend) 0-100µM ProFAR

600nM His A

in 50mM Tris Acetat, pH 8.0

Die Reaktion wurde bei RT durchgeführt und durch Zugabe von 0,1µM HisH:HisF gestartet und über die Abnahme der Absorption bei 300nm verfolgt.

Methoden 73 nach einigen Minuten durch Zugabe des HisH:HisF Komplexes bzw. der Varianten gestartet.

Für die ammoniumabhängige Reaktion ist die Anwesenheit von HisH im Prinzip nicht erforderlich, dennoch wurden wegen der Vergleichbarkeit mit der glutaminabhängigen Gesamtreaktion und der HisH-Teilreaktion alle Messungen mit dem HisH:HisF Komplex durchgeführt. Die Reaktion wurde über den Abfall der Absorption bei 300nm verfolgt und quantifiziert (∆ε300 (5´ProFAR – AICAR) = 5,64 mM^-1.cm^-1, Klem & Davidson, 1993). Als Ammoniak-Quelle diente NH4+

Acetat (100mM), welches in 50mM Tris Acetat bei pH 8,5 rund 17mM Ammoniak entspricht (Henderson-Hasselbalch-Gleichung).

Es wurden unter Sättigung mit Ammoniak und PRFAR gesamte Umsatzkurven aufgenommen und durch Fit mit der integrierten Michaelis-Menten-Gleichung (COSY, Eberhard, 1990) die katalytischen Parameter KMPRFAR

und Vmax bzw. kcat bestimmt. Zusätzlich wurden unter Sättigung mit Ammoniak und unterschiedlichen PRFAR-Konzentrationen Anfangssteigungen bestimmt und daraus Sättigungskurven erstellt. Daraus wurden wiederum KMPRFAR

und Vmax

bzw. kcat ermittelt. Die wichtigsten Versuchsbedingungen für wildtypisches HisH:HisF im Überblick:

4.4.11.3 Messung der Glutaminase-HisH-Teilreaktion

Die Glutaminase-Reaktion ist die von HisH katalysierte Teilreaktion, d.h. die Hydrolyse von Glutamin zu Glutamat und NH3. Die Glutaminase-Aktivität sowohl von isoliertem HisH als auch des HisH:HisF Komplexes aus T. maritima ist so gering, dass sie mit der verwendeten Methode nicht nachweisbar ist (Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001). Erst durch die Bindung eines Liganden an HisF findet eine Stimulierung der Glutaminase-Aktivität statt.

Neben dem HisA-Substrat ProFAR hat sich auch das HisF-Produkt ImGP als wirksamer Ligand erwiesen (Klem & Davisson, 1993; Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001).

100mM NH4+

Acetat (sättigend) 0-100µM ProFAR

600nM His A

in 50mM Tris Acetat, pH 8.5

Die Reaktion wurde bei RT durchgeführt und durch Zugabe von 0,1µM HisH:HisF gestartet und über die Abnahme der Absorption bei 300nm verfolgt.

Methoden 74 Da die Hydrolyse von Glutamin zu Glutamat und Ammoniak mit keiner Absorptionsänderung verbunden ist, wurde der Reaktion die Glutamat-Dehydrogenase (GDH)-Reaktion nachgeschaltet. Durch die GDH wird Glutamat zu 2-Oxoglutarat oxidiert. Die damit einhergehende NAD⁺-Reduktion zu NADH⁺ ist durch eine Zunahme der Absorption bei 340nm nachweisbar. Es wurden die Anfangssteigungen der Reaktion in Abhängigkeit von der Glutaminkonzentration gemessen und daraus Sättigungskurven erstellt. Daraus wurden KMGln

und Vmax bzw. kcat ermittelt. Die wichtigsten Versuchsbedingungen für wildtypisches HisH:HisF im Überblick:

0-150 mM Glutamin 5mM NAD⁺

0,75mg/ml GDH

50µM ProFAR (sättigend) in 50mM Tricin/KOH, pH 8.0

Die Reaktion wurde bei RT durchgeführt und durch Zugabe von 1µM HisH:HisF gestartet und über die Zunahme der Absorption bei 340nm verfolgt.

Ergebnisse und Diskussion – Kapitel 1 75

5 Ergebnisse und Diskussion

Die durchgeführten Experimente und deren Auswertung und Diskussion gliedern sich in vier Kapitel. Nach einer kurzen Vorstellung der drei Enzyme HisH, HisF und TrpG aus T. maritima und ihrer Beziehung zueinander in Kapitel (1) werden in Kapitel (2) der Proteinkomplex HisH:HisF, sowie die strukturellen und funktionellen Eigenschaften hergestellter HisH und HisF Varianten beschrieben. Kapitel (3) enthält die Charakterisierung von wildtypische m TrpG und Kapitel (4) beschäftigt sich mit der Untersuchung der Evolution der Glutaminasen anhand hergestellter TrpG Varianten im Vergleich zu HisH.

Kapitel 1: Die Enzyme HisH, HisF und TrpG aus Thermotoga maritima

5.1.1 DALI-Suche zur Identifizierung von Proteinen mit signifikanter