Anhänge
Anhang 2 Standardarbeitsanweisung - Analyseverfahren zur Be- Be-stimmung ausgewählter Pyrethroide nach
Luftproben-ahme auf Glasfaserfiltern
Einleitung/Zweck dieser Arbeitsanweisung
Diese Arbeitsanweisung beschreibt die Extraktion der Substanzen Piperonylbutoxid (PBO), Tetramethrin und Phenothrin von Glasfaserfiltern und ihre anschließende Quantifizierung mittels Gaschromatographie und massenspektrometrischer Detektion (GC-MSD). Die Methode basiert auf der Dissertation von ELFLEIN (2003) und der VDI-Richtlinie 4301-Blatt 4 (2016).
Vorgehensweisen Prinzip der Methode
Glasfaserfilter werden mit Ethylacetat im Ultraschallbad extrahiert. Nach Aufkonzent-ration der Extrakte erfolgt die Quantifizierung der Analyte (PBO, Tetramethrin, Phe-nothrin) mittels GC-MSD unter Verwendung von PBO-d9 als internem Standard (ISTD).
Geräte und Hilfsmittel
• GC-MSD-Kopplung (zum Beispiel: Agilent 7890A / 5975C mit HPChemStation und Autosampler)
• Eppendorf-Pipetten (verschiedene Größen)
• Messkolben (1 und 10 mL)
• Pinzette
• Analysenwaage (Sartorius, Research RC 210S)
• Ultraschallbad (Bandelin SONOREX bzw. Omnilab)
• Konzentrator (engl. Concentration workstation), (TurboVap II von Zymark bzw.
Biotage) einschließlich Gläser
• Bechergläser
• Autosamplervials (2mL, Braunglas; Agilent Technologies)
• Aluminiumfolie
• Glasfaser-Filter (37 mm; Whatman oder ähnlich) Chemikalien und Lösungsmittel
• Ethylacetat (kurz: EtAc; z. B. SupraSolv, Merck, Darmstadt, Deutschland)
• Piperonylbutoxid (kurz: PBO, z. B. Pestanal®, Sigma-Aldrich, Produkt-Nummer:
45626)
• Piperonylbutoxid-d9 (kurz: PBO-d9, z. B. Sigma-Aldrich, Produkt-Nummer:
73879)
• Tetramethrin (Pestanal®, z. B. Sigma-Aldrich, Produkt-Nummer: 45681)
• Phenothrin (Pestanal®, z. B. Sigma-Aldrich, Produkt-Nummer: 36193)
Lösungen
Standardlösungen:
Analyt-Standardlösung 1 Tetramethrin
Die Reinsubstanz (ca. 10 mg) wird genau abgewogen und in 10 mL Ethylacetat gelöst.
Die finale Analyt-Konzentration ergibt sich anhand der Einwaage sowie der Reinheit der Substanz (siehe z. B. Analysenzertifikat des Herstellers).
Das Ansetzen der Lösung erfolgt mittels geeigneter Waage und Messkolben.
Beispiel: Es werden 8,70 mg Tetramethrin (Reinheit: 98,3 %) genau abgewogen und in 10 mL Ethylacetat gelöst. Daraus resultiert eine Analytkonzentration von 0,855 mg/mL.
Phenothrin
Die Reinsubstanz (ca. 10 mg) wird genau abgewogen und in 10 mL Ethylacetat gelöst.
Die finale Analyt-Konzentration ergibt sich anhand der Einwaage sowie der Reinheit der Substanz (siehe z. B. Analysenzertifikat des Herstellers).
Das Ansetzen der Lösung erfolgt mittels geeigneter Waage und Messkolben.
Beispiel: Es werden 8,40 mg Phenothrin (Reinheit: 94,4 %) genau abgewogen und in 10 mL Ethylacetat gelöst. Daraus resultiert eine Analytkonzentration von 0,793 mg/mL.
Piperonylbutoxid (PBO)
Die Reinsubstanz (ca. 10 mg) wird genau abgewogen und in 10 mL Ethylacetat gelöst.
Die finale Analyt-Konzentration ergibt sich anhand der Einwaage sowie der Reinheit der Substanz (siehe z. B. Analysenzertifikat des Herstellers).
Das Ansetzen der Lösung erfolgt mittels geeigneter Waage und Messkolben.
Beispiel: Es werden 8,98 mg Piperonylbutoxid (Reinheit: 98,6 %) genau abgewo-gen und in 10 mL Ethylacetat gelöst. Daraus resultiert eine Analytkonzentration von 0,885 mg/mL.
Analyt-Standardlösung 2
Die Standardlösungen 1 (Tetramethrin, Phenothrin und PBO) werden zu einem Analyt-Mischstandard mit einer nominalen Konzentration der individuellen Analyten von 10 µg/mL in Ethylacetat verdünnt.
Das Ansetzen der Lösung erfolgt mittels geeigneter Pipetten und Messkolben.
Beispiel:
In einem Messkolben wird Ethylacetat vorgelegt, die Standardlösungen 1 entspre-chend dem nachfolgenden Pipettierschema (Anh. Tab. 2) zugesetzt und der Kolben bis zur Marke mit Ethylacetat aufgefüllt.
Anh. Tab. 2 Analyt – Standardlösung 2 (Mischstandard; 10 µg/mL): Pipettierschema Analyt Volumen Analyt-Standardlösung 1
[µL]
Analyt – Standardlösung 3
Die Analyt-Standardlösung 2 wird 1:10 in Ethylacetat verdünnt. Die Konzentration der einzelnen Analyten in der Lösung betrug 1 µg/mL.
Das Ansetzen der Lösung erfolgt mittels geeigneter Pipetten und Messkolben.
Beispiel: In einem 10 mL-Messkolben werden 2 mL Ethylacetat vorgelegt, an-schließend 1 mL der Analyt-Standardlösung 2 dazugegeben und der Kolben bis zur Marke mit Ethylacetat aufgefüllt.
Interner Standard (ISTD) – Lösung 1
Als ISTD wird PBO-d9 eingesetzt. Die Reinsubstanz (10 mg; Reinheit: 100 %) wird in einer Ampulle geliefert, diese wird geöffnet und die Substanz in 2 mL Ethylacetat ge-löst. Die finale ISTD-Konzentration beträgt 5 mg/mL.
Das Ansetzen der Lösung erfolgt mittels geeigneter Waage und Messkolben.
Interner Standard (ISTD) – Lösung 2
Die ISTD-Lösung 1 wird 1:500 in Ethylacetat verdünnt. Dazu werden ca. 5 mL Ethyl-acetat in einem 10 mL Messkolben vorgelegt, 20 µL der ISTD-Lösung 1 dazugegeben und anschließend der Kolben bis zur Marke mit Ethylacetat aufgefüllt. Die Konzentra-tion der ISTD Lösung 2 beträgt demnach 10 µg/mL.
Das Ansetzen der Lösung erfolgt mittels geeigneter Pipetten und Messkolben.
Kalibrierlösungen:
Matrix
Alle Kalibrier-, und Blindwertlösungen werden in Filtermatrix angesetzt.
Dazu werden die jeweiligen Filter in Stücke geschnitten, in ein 50 mL-Becherglas ge-geben und nach Zugabe von 10 mL Ethylacetat im Ultraschallbad für 5 min extrahiert.
Der Überstand wird in ein 250 mL Turbo-Vap Glas überführt. Der Extraktionsschritt wird anschließend noch zweimal wiederholt. Die Aufkonzentrierung der vereinigten Ex-trakte auf ca. 0,5 mL erfolgt in einem Konzentrator (Turbo-Vap II) bei 40 °C Wasser-badtemperatur. Der aufkonzentrierte Extrakt wird dann durch eine mit Glaswatte ge-pfropfte Eppendorf-Pipettenspitze in einen 1 mL Messkolben filtriert. Das Endvolumen wird mit Ethylacetat auf 1 mL eingestellt.
Für das Ansetzen der Kalibrier-, und Blindwertlösungen werden auf diese Weise zum Beispiel 20 Filter individuell aufgearbeitet und am Ende zu einer Matrix zusammenge-führt.
Kalibrierlösungen
Neun Kalibrierlösungen werden durch entsprechende Verdünnungen der Analyt-Stan-dardlösungen 2 und 3 in Matrix (Anh. Tab. 3) hergestellt. Die Kalibrierstandards de-cken einen Konzentrationsbereich von 5 bis 500 ng/mL ab. Es hat sich als sinnvoll
erwiesen diesen Konzentrationsbereich weiter zu unterteilen, zum Beispiel 5 – 100 ng/mL und 100 – 500 ng/mL, um eine ausreichende Linearität der Kalibrierfunktion zu gewährleisten.
Das Ansetzen der Standards erfolgt mittels geeigneter Mikroliterspritzen und Messkol-ben.
Anh. Tab. 3 Angaben zum Ansetzen von Kalibrierlösungen
Konzentration
QC-Lösungen dienen zur Kontrolle der Kalibrierung und werden sowohl an den Beginn als auch am Ende einer Probensequenz eingebunden. Bei umfangreichen quenzen ist es sinnvoll QC-Lösungen in regelmäßigen Intervallen in die Probense-quenz zu implementieren.
Glasfaserfilter werden für drei Konzentrationsstufen, 7,5; 100 und 450 ng/Filter, prä-pariert. Dazu werden die Filter mit jeweils 7,5; 10 bzw. 45 µL der Analyt-Standardlö-sung 2 dotiert. Jeder Filter wird zudem mit 10 µL der ISTD-LöAnalyt-Standardlö-sung 2 dotiert. Die so präparierten Filter werden anschließend wie unter Punkt „Probenaufarbeitung“ be-schrieben aufgearbeitet. Das Extrakt-Endvolumen beträgt 1 mL, woraus sich die fol-genden Extrakt-Konzentrationen für die QC-Standards ergeben:
QCLow: 75 ng/mL
QCMed: 100 ng/mL
QCHigh: 450 ng/mL.
Das Ansetzen der Standards erfolgt mittels geeigneter Mikroliterspritzen und Messkol-ben.
Probenaufarbeitung
Zur Probenaufarbeitung werden die jeweiligen Filter in Stücke geschnitten, in ein 50 mL-Becherglas gegeben und nach Zugabe von 10 mL Ethylacetat im Ultraschall-bad für 5 min extrahiert. Der Überstand wird in ein 250 mL Turbo-Vap Glas überführt.
Der Extraktionsschritt wird anschließend noch zweimal wiederholt. Die Aufkonzentrie-rung der vereinigten Extrakte auf ca. 0,5 mL erfolgt in einem Konzentrator (Turbo-Vap II) bei 40 °C Wasserbadtemperatur. Der aufkonzentrierte Extrakt wird dann durch eine