Stabilität der nichtenzymatischen Antioxidantien

Die Ergebnisse in 4.1.1, Seite 44 zeigen, dass die Konzentration der TEAC bei einer Lagerung von bis zu sechs Stunden nur geringgradigen Schwankungen unterliegt und sich daher zunächst stabil darstellt. Nach sechs Stunden Lagerung steigt die TEAC geringgradig an, wobei ein stärke-rer Anstieg nach 24 Stunden zu verzeichnen ist.

Die Untersuchungen der ACW 4.1.2, Seite 46 zeigen, dass die ACW im Gegensatz zur TEAC bereits zu Beginn der Lagerungszeit Schwankungen unterliegt. So sinkt bereits bei dreistündiger Lagerung vor Aufbereitung die Konzentration der ACW ab. Nach sechsstündiger Lagerung liegt die ACW geringfügig höher und nach 24 Stunden Lagerung liegt die Konzentration in der Nähe des Ausgangswertes.

Ein Sinken der Konzentrationen kann verschiedene Ursachen haben, entweder durch einen Verbrauch der Antioxidantien über Radikale oder durch eine Zerstörung/einen Zerfall der Antio-xidantien.

Eine schnell einsetzende Abnahme der Kapazität ist durch einen Verbrauch antioxidativer Sub-stanzen denkbar. Ein solcher Verbrauch kann über eine vermehrte Radikalbildung zustande kommen. Unter Einfluss von Sauerstoff ist eine Sauerstoffradikalbildung nahe liegend, in der vorliegenden Arbeit spricht jedoch dagegen, dass die in Stickstoffatmosphäre aufbereiteten Pro-ben ePro-benfalls in ihrer ACW-Konzentration sinken. Allerdings können auch in Stickstoffatmo-sphäre Radikale entstehen. NO ist ebenfalls reaktiv und bildet Komplexe mit Hämoproteinen, kann Innenstrukturen von Eisen und Sulfatverbindungen inaktivieren, bildet Nitrosothiole und reagiert mit Superoxid zu Peroxinitrit. Peroxinitrit wiederum ist eine instabile starke Oxidans, die - ähnlich wie das Hydoxylradikal - schnell mit Thiolen reagieren kann (BERGAMINI et al.

2004).

Denkbar ist auch ein Verbrauch der Antioxidantien durch Radikalbildung der Leukozyten im Vollblut, denn Leukozyten produzieren Radikale. Sauerstoffunabhängig werden in den Granula polymorphkerniger Leukozyten hydrolytische Proteasen wie Elastase und Kollagenase freige-setzt. Andererseits werden in Anwesenheit von Sauerstoff aus molekularem Sauerstoff hochreak-tive Sauerstoffradikale über die NADPH-Oxidase gebildet (SCHLIEPHAKE 2006). Hierzu ge-hören u. a. hypochlorige Säure und Hydroxylradikale (BECK 2004, UHL et al. 1999 a).

PICKER et al. stellten 2004 fest, dass leukozytengefiltertes Blut bis zu 42 Tage stabil ist und vermuten, dass durch diese Filterung die Radikalbildung der Leukozyten signifikant niedriger ausfällt bzw. entfällt. Ähnliches bestätigen auch KWAN SON et al. (1996). Sie prüften die zyto-toxische Aktivität von menschlichen Monozyten unter unterschiedlichen Bedingungen. Die Ak-tivität der Proben war sehr instabil, bei Lagerung über Nacht im Vollblut kam es zu einem star-ken Absinstar-ken der untersuchten Parameter. Daher raten sie, die Proben zuerst aufzubereiten (Se-rumgewinnung) und dann bei 4°C aufzubewahren. Zu einer sofortigen Deproteinierung von Plasmaproben nach Blutentnahme raten MOSHAGE et al. (1995). Eine weitere Begründung für eine Abnahme speziell der ACW ist eine sinkende Konzentration durch schnell flüchtige oder abbaubare Substanzen. Es ist auffällig, dass die Konzentration der ACW im Gegensatz zur TEAC innerhalb der ersten drei Stunden Lagerung vor Aufbereitung sogleich abnimmt. Eine Erklärung für diese unterschiedliche Reaktion liefert die Zusammensetzung der beiden Summen-parameter. So wird ein Großteil der ACW von Vitamin C und Harnsäure gestellt. Besonders Vi-tamin C zerfällt sehr schnell und würde damit eine schnelles Absinken der ACW (FARAHMAND et al. 2006) erklären.

Zu einem Ansteigen der Konzentrationen von TEAC und ACW kann es zum einen über einen sinkenden Verbrauch durch Radikale und zum anderen durch Freisetzung von Antioxidantien aus den Zellen ins Plasma/Serum kommen (s. auch Abbildung 5-1, S. 62). Eine Abnahme der Radi-kalwirkung/-bildung und damit ein Anstieg der Antioxidantienkonzentrationen ist in vorliegen-der Arbeit nur über eine Abnahme vorliegen-der Reaktion vorliegen-der Umgebungsatmosphäre (im Sinne einer ab-nehmenden Sauerstoffradikalbildung bzw. Stickstoffradikalbildung) in den Probenröhrchen zu erklären. Es stellt sich die Frage, ob oxidativer Stress auch im Sinne einer längeren Lagerung von Proben anzusehen ist. In Anwesenheit von Sauerstoff können sich im Probenröhrchen Sauerstoff-radikale bilden, die möglicherweise die Zellmembranen angreifen, z. B. Superoxidanionenradika-le, HydroxylradikaSuperoxidanionenradika-le, Wasserstoffperoxid und Singulettsauerstoff (WINNEFELD 1996, NOMURA et al. 2001). Diese Radikalbildung muss mit zunehmender Lagerungsdauer abneh-men, um die steigenden Konzentrationen von ACW und TEAC zu erklären. Auffällig ist, dass die Konzentrationen der Sauerstoffproben gleichermaßen wie die Stickstoffproben ansteigen.

Eine so gleichmäßige Reaktion bei den unterschiedlichen Aufbereitungsweisen (Sauer-stoff/Stickstoff) ist kaum zu erwarten. Laut KOLB (1989) kommt Vitamin E im Plasmalemm und in den Mitochondrien der Zellen vor. Vitamin E nimmt als α-Tocopherol einen nicht gerin-gen Anteil der TEAC ein. Eine mögliche Erklärung für einen Anstieg der Konzentration der

TEAC wäre demnach eine Freisetzung von α-Tocopherol aus den Wänden der Zellen, in diesem Fall der Erythrozyten. Je länger die Vollblutproben vor der Aufbereitung stehen, desto mehr To-copherol, möglicherweise auch andere Bestandteile, wird aus den Erythrozytenmembranen frei-gesetzt, tritt damit zunächst ins Plasma und bei Aufbereitung der Proben ins Serum über und wird anschließend darin als erhöhte TEAC-Konzentration gemessen. Eine Freisetzung nichten-zymatischer Antioxidantien aus den Zellen beschreibt auch DINGES (2004). Auch bei der ACW steigen die Konzentrationen langsam an und sind nach 24 Stunden wieder fast auf Ausgangshö-he. Für diese Erholung der Kapazität kommt als Erklärung ähnlich wie bei der TEAC ein ver-mehrtes Freisetzen von Antioxidantien aus dem Vollblut und somit aus dem intrazellulären Be-reich (Erythrozyten) in das Plasma bzw. Serum in Frage.

Abbildung 5-1: Regelmechanismus von TEAC und ACW bei Lagerung

Der unterschiedliche Verlauf der Konzentration von TEAC und ACW ist über die Zusammenset-zung dieser nichtenzymatischen Antioxidantien erklärbar. So sind Komponenten wie Vitamin C sowohl in der TEAC als auch in der ACW erfasst (MILLER et al. 1993), andere Komponenten wie Tocopherol gehen wiederum nur in die TEAC (WOODFORD u. WHITEHEAD 1998) ein

Antioxidantien bei Lagerung Antioxidantien↑

Antioxidantien↓

Radikalbildung↓

▼ Verbrauch↓

Freisetzung aus Zellen in Plasma/Serum

Verbrauch↑

durch Radikale aus Umgebung

schnell flüchtige Komponenten

(z.B. Vit. C)

und können damit ein von der ACW abweichendes Stabilitätsverhalten bei der Lagerung vor Probenaufbereitung erklären. Der biphasische Verlauf, den POPOV u. LEVIN (1999) beschrei-ben, bietet einen theoretischen Hintergrund dafür. Die fettlöslichen Komponenten lassen die Konzentration der TEAC langsamer sinken als die ACW, dafür treten diese Komponenten mög-licherweise auch langsamer aus den Zellen des Vollblutes ins Serum über als die wasserlösli-chen, was den abweichenden Verlauf der ACW im Vergleich zur TEAC erklären würde. So be-schreiben WAYNER et al. (1987) für die TEAC ihrerseits, dass bei Stress zunächst der Anteil an Plasmasulfhydrylgruppen und Uraten verbraucht wird und erst danach die fettlöslichen Anteile wie α-Tocopherol.