Stabile Transformation

Weizen der Varietät ‚Bobwhite SH 98 26’ wurde nach der Methode von Pellegrineschi et al. (2002) transformiert. In Abbildung 25 ist der Ablauf der stabilen Transformation von Weizen schematisch dargestellt. Abbildung 26 zeigt einzelne Schritte wie Präparation der Embryonen, Kallusbildung und Regeneration transgener Pflanzen.

Abbildung 25: Schematisches Schaubild zum zeitlichen Ablauf der Weizentransformation. Der gesamte Vorgang von Partikelbeschuss der Embryonen bis zur Gewinnung von transgenen Pflanzen (T0-Generation) dauert mindestens 3 Monate; Pflanzen der ersten Nachkommen-Generation (T1-Nachkommen-Generation) können frühestens 4,5 bis 5 Monate nach Partikelbeschuss analysiert werden.

Es gibt prinzipiell 4 Parameter, die die Effizienz der Weizentransformation bestimmen:

Der Genotyp des verwendeten Weizenkultivars, der Zustand der Donorpflanzen, Beschussbedingungen und Dauer und Art der Gewebekultur. Einen umfassenden

Unreife Samen

Präparation unreifer Embryonen

Biolistische Transformation der Embryonen

Kultivierung von embryogenem Kallus im Dunkeln 2-3 Wochen

Regeneration und Selektion von Pflänzchen 6-10 Wochen Aufzucht der vermuteten transgenen Pflanzen

(T0-Generation)

4-8 Wochen Aufzucht der vermuteten transgenen Pflanzen

(T1-Generation)

6-10 Wochen Phänotypische und molekulare Analyse

Überblick über die verwendete Methoden der Weizentransformation bieten Ingram et al., (2001) und Bhalla et al. (2006).

Beschussbedingungen können durch Veränderung physikalischer und biologischer Parameter verändert werden. Physikalische Parameter schließen ein: Art der Fällung der verwendeten DNA auf Microcarrier, Art und Größe der Microcarrier, Beschusssystem, Beschussdruck, angelegter Unterdruck, Abstand zwischen Berstscheibe und Macrocarrier, Abstand zwischen Macrocarrier und Stoppgitter und Abstand zwischen Stoppgitter und zu beschießendem biologischen Material. Biologische Parameter umfassen: Größe der verwendeten Embryonen, Art der Exzision der Embryonen aus den Körnern, Vorkultur der Embryonen zur Induktion von embryogenem Gewebe vor Beschuss, Art und Dauer einer Vorbehandlung der Embryonen vor und nach Beschuss. Grundsätzlich werden die Beschussbedingungen so gewählt, dass eine Schädigung der Embryonen durch den Beschuss mit Microcarriern minimiert wird und gleichzeitig die Einbringung der verwendeten DNA in den Zellkern transformierter Zellen möglichst effizient ist. Bei zu starker Schädigung der Embryonen entsteht kein oder zu wenig embryogener Kallus, die Regenerationsrate und damit die Transformationsrate sinkt. Bei ungenügendem Transfer von DNA entsteht kein oder zu wenig transgener Kallus, so dass aus dem embryogenen Kallus keine transgenen Pflanzen entstehen.

Die beschossenen Embryonen werden für zwei bis vier Wochen im Dunkeln kultiviert, um die Entstehung embryogenen Kallus zu fördern. Hierbei spielt die Art des Gewebekulturmediums und die Höhe der Auxinkonzentration in diesem Medium eine entscheidende Rolle. Auch kann bereits in diesem Stadium ein Selektionsagens zugefügt werden. Zumeist werden Medien verwendet, die auf dem MS-Medium beruhen (Murashige und Skoog, 1962). Als künstliches Auxin wird meist 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) verwendet. An diese Kultivierungsphase schließt sich eine Regenerationsphase im Licht an. Dazu werden die Kalli auf Regenerationsmedium überführt, welches üblicherweise kein Auxin mehr enthält. Diesem Regenerationsmedium wird ein Selektionsmittel zugeführt, um die Entstehung nicht-transgener Pflanzen zu hemmen.

Zwar wurden die Parameter Genotyp, Beschussbedingungen und Gewebekultur von Pellegrineschi et al. (2002) optimiert, doch treten auch am CIMMYT nicht erklärbare Schwankungen der Qualitität der Donorpflanzen auf, die die Transformationseffizienz stark beeinträchtigen. Es ist zwar allgemein anerkannt, dass möglichst vitale

Donorpflanzen essentiell für einen Transformationserfolg sind, wie dieser Zustand aber erreicht und gemessen werden kann, bleibt unklar. Nimmt man noch die häufigen Ausfälle durch Infektionen der Gewebekultur hinzu, sollte man Angaben sowohl zur Reproduzierbarkeit als auch Höhe der veröffentlichten Transformationseffizienzen im Allgemeinen mit einem Fragezeichen versehen. Da es in der Weizentransformation notwendig ist, auf embryonales Gewebe zurückzugreifen, scheint die intensive Erforschung der Parameter, die die Qualität der Donorpflanzen und damit des embryonalen Gewebes bestimmen, eine vordringliche Aufgabe, da andernfalls eine reproduzierbare Etablierung der Transformationsmethode nicht gewährleistet werden kann.

2.4.6.1 Plasmide

Zur Durchführung der stabilen Transformation wurden Plasmide verwendet, die mit Hilfe des Plasmid Midi Kits (Qiagen, Hilden) aus E.coli isoliert worden waren. Die Konzentration wurde mittels Spektroskopie (siehe Abschnitt 2.2.2) auf 0,5 µ g/µl eingestellt. Die Qualität der DNA wurde auf einem Agarosegel überprüft.

2.4.6.2 Medien MSE3-Medium

Dieses Medium wurde für die Induktion von embryogenem Kallus verwendet und basiert auf dem MS Medium von Murashige and Skoog (1962).

Tabelle 1: Zusammensetzung des MSE3-Mediums.

1000 ml MS Makroelemente (10×) 200 ml MS Mikroelemente (10×) 100 ml MS Vitamine (1000×) 1 ml

Thiamin-Cl 0.040 mg

L-Asparagin 0.150 g

Saccharose 20 g

2,4-D (1 mg/ml) 2.5 ml

Bacto-Agar 9 g

Für das MSE3-Maltose-Medium zur Behandlung der Embryonen vor dem Beschuss wurde Saccharose durch Maltose (15 % w/v) ersetzt.

MS Makroelemente, MS Mikroelemente, MS Vitamine, Thiamin-Cl, Asparagin, Saccharose, 2,4-D und Maltose wurden von Sigma (München) bezogen, Bacto-Agar von Becton Dickinson (Sparks, MD, USA).

MSR-Medium

Dieses Medium wurde zur Regeneration der Weizenpflanzen aus Kallus verwendet und basiert ebenfalls auf dem MS Medium von Murashige and Skoog (1962). Zur Selektion vermuteter transgener Weizenpflanzen mit einer Resistenz gegen Phosphinotricin (PPT) wurden nach Sterilisation des Mediums 5 ml einer PPT-Lösung (1 mg/ml) zugegeben. Die PPT-Lösung wurde nach Sterilisation mit Filtropur S 0.2 Filtern von Sarstedt AG & Co (Nürnbrecht) bei 4 °C aufbewahrt.

Tabelle 2: Zusammensetzung des MSR-Mediums.

1000 ml MS Salze 4.43 g Thiamin-Cl 0.040 mg L-Asparagin 0.15 g Saccharose 20 g Bacto-Agar 9 g

MS Salze wurden von Sigma (München) bezogen, Phosphinotricin (PPT) von Duchefa (Haarlem, Niederlande).

2.4.6.3 Partikelbeschuss

Der Partikelbeschuss wurde wie in Abschnitt 2.4.4 beschrieben durchgeführt, allerdings mit einigen kleinen Modifikationen. So betrug die Distanz zwischen Berstscheibe und Makroprojektil ca. 20 mm, zwischen Makroprojektil und Abstoppgitter ca. 8 mm und zwischen Abstoppgitter und Zielgewebe 9,8 cm. Es wurden 900 psi-Berstscheiben verwendet.

2.4.6.4 Vorbereitung des Zielgewebes

Die unreifen Körner wurden wie in Abschnitt 2.4.5 beschrieben sterilisiert, wobei bei der Präparation der Embryonen die Embryonalachse mit einem Skalpell entfernt wurde Abbildung 26 A, B). Es wurden vorzugsweise etwa 1 mm große Embryonen verwendet, die auf MSE3-Maltose-Medium platziert wurden. Die Präparation der Embryonen wurde vormittags durchgeführt, der Partikelbeschuss am frühen Nachmittag. Daraus ergibt sich eine unterschiedliche Verweildauer der Embryonen auf dem MSE3-Maltose-Medium von einer bis vier Stunden.

2.4.6.5 Gewebekultur

Die Embryonen wurden entweder am Tag des Beschusses oder am darauffolgenden Tag von MSE3-Maltose-Medium auf MSE3-Medium überführt. Sie wurden für 2 bis 3 Wochen im Dunkeln bei 27°C kultiviert, um die Kallusbildung hervorzurufen (Abbildung 26 C, D).

Zum Zeitpunkt des Transfers sollten die Kalli zwischen 0,4 bis 0,7 cm groß sein. Die beste Regenerationsfähigkeit zeigt embryogener, globulärer Kallus, der etwas härter und cremefarben ist. Üblicherweise formt sich embryogener Kallus an den Seiten des Embryos.

Der Kallus sollte spätestens nach 3 Wochen auf das Regenerationsmedium MSR überführt werden, das als Selektionsmittel 5 mg/l Phosphinotricin (Duchefa, Haarlem, Niederlande) enthält, und in eine Lichtkammer bei 26°C und einer Photoperiode von 16h:8h gestellt werden, um die Entstehung von Schossen zu induzieren (Abbildung 26 E, F). Sobald Pflänzchen aus den Transformationsexperimenten regeneriert sind und die Kontrolle (Kallus aus nicht transformierten Embryonen) abgestorben ist, werden die vermuteten transgenen Pflanzen entweder einer zweiten Selektionsrunde unterworfen oder zur Wurzelbildung in MS Medium ohne Selektionsmittel überführt (Abbildung 26 G). Wenn die Pflanzen stark genug sind und ein gut entwickeltes Wurzelsystem haben, erfolgt die Überführung in Erde. Sie bleiben dann für etwas 3 Tage unter einer Plastikhaube in einer Klimakammer und werden dann in das Gewächshaus überführt (Abbildung 26 H).

A B

D C

E F

G H

Abbildung 26: Ablauf der Weizentranformation. (A) Präparation unreifer Embryonen aus Körnern.

(B) Unreife Embryonen vor biolistischem Beschuss. (C) Embryonen 2-3 Wochen nach Kultivierung im Dunkeln. (D) Embryogener Kallus. (E, F) Aus embryogenem, transgenem Kallus sich regenerierender, gfp-exprimierender Spross, (E) im Tageslicht, (F) nach Anregung der GFP-Fluoreszenz. (G) Selektion vermuteter transgener Schösslinge im Vergleich zur Kontrolle (untere Hälfte, nicht transformiert). (H) Aufzucht transgener Pflanzen. Der Größenmaßstab in A bis F stellt jeweils 1 mm dar. Die Weizenpflanzen in H haben etwa eine Höhe von 10 cm.

2.5 Analyse der transgenen Weizen-Pflanzen