beschriebenen Säuger-MT ist eine erhöhte Transkriptakkumulation nach Zink- oder Cadmiumzugabe zu verzeichnen (Andrews, 2000). Für die Hefe-MT ist Kupfer der stärkste transkriptionelle Aktivator (Fürst et al., 1988). Außerdem ist auch oxidativer Streß ein Induktor der MT Expression.
In der vorliegenden Arbeit sollte die Transkriptakkumulation des zym1 nach verschiedenen Streßapplikationen untersucht werden. Eine starke Induktion war hier nach Behandlung mit H2O2 zu verzeichnen. Hierauf wird im nächsten Kapitel näher eingegangen werden.
Prinzipiell konnte ein unterschiedliches Induktionsmuster zwischen den im EMM- und den im YE-Medium angezogenen Wildtypkulturen beobachtet werden (Abb. 3.14-1A). Die Behandlung mit Kupfer ergab nur eine leichte Erhöhung der Transkriptmenge. Unter YE-Bedingungen konnten eine Transkriptakkumulation nach hohen Konzentrationen von Cadmium, Kupfer und Zink ermittelt werden (Abb. 3.14-1B). Hierbei war die Induktion nach
2 mM Zink besonders stark. Beachtet man die in Tabelle 3.2-1 aufgelisteten IC50-Werte, so erkennt man, daß abgesehen vom Kupfer die Transkriptakkumulation des zym1 bei Konzentrationen stattfindet, die weit höher als die ermittelten IC50-Werte liegen. Die Zellen zeigten in den Wachstumsassays schon ein sehr stark eingeschränktes Wachstum. Die Werte ab 100 µM CdCl2, 5 mM CuCl2 und 2 mM ZnCl2 wurden nur gewählt, um sie mit den von Borrelly et al. ermittelten Daten zu vergleichen (Borrelly et al., 2002). Ein Wachstum des Wildtyps unter diesen Bedingungen war kaum noch möglich. Speziell die Behandlung mit 5 mM CuCl2 zeigte schon erste zellytische Effekte. Die Interpretation der Transkriptakkumulation besonders unter YE-Bedingungen ist daher erschwert. Auf Grund der zelltoxischen Wirkung der Metalle der eben diskutierten Konzentrationen kann nicht ausgeschlossen werden, daß die Induktion des zym1 eher durch sekundäre Effekte als durch Metallionen ausgelöst wird. Eine metallabhängige, da in subletalen Konzentrationen zu beobachtende Transkriptakkumulation, kann nur für das Kupfer angenommen werden. Diese Induktion konnte in beiden Medien in Konzentrationen um den IC50-Wert beobachtet werden.
Interessanterweise konnte eine leichte Transkriptakkumulation auch nach Kobaltbehandlung ermittelt werden. Diese tritt im EMM-Medium nur sehr leicht, im YE-Medium aber etwas stärker auf. Eine in vivo Kobaltbindung an MT ist nicht bekannt. Allerdings konnte eine Induktion des MT durch Kobalt schon an anderer Stelle gezeigt werden (Tohoyama et al., 2001). In S. cerevisiae wurde die Expression von CUP1 durch Kobalt aktiviert. Diese Induktion wurde allerdings nicht durch den Transkriptionsfaktor ACE1 vermittelt.
Nach Kupferzugabe und hohen Konzentrationen an Cadmiumionen konnte ein zweites Transkript mit einer Größe von ca. 190 Basen detektiert werden. Dieses Transkript ist unabhängig von der Expressionsstärke des zym1. Obwohl H2O2 und 2 mM ZnCl2 die höchsten Transkriptakkumulationen aufweisen, konnte das zweite Transkript hier nicht detektiert werden. Eine mögliche Erklärung für dieses Transkript könnte in einem zweiten Transkriptionsstart liegen. Ein zweites ATG und eine 5 bp stromaufwärts gelegene TATA-Box konnten in der nicht kodierenden Sequenz gefunden werden. Allerdings müßte das zweite Transkript noch etwa 80 Basen größer sein als ermittelt. Jedoch soll hier ein Fehler bei der Größenbestimmung der generell schon sehr kleinen Transkripte nicht ausgeschlossen werden.
4.9. ∆zym1 ist nicht sensitiver gegenüber oxidativem Streß
Metallothioneine vieler Organismen wurden als Antioxidantien beschrieben. Dabei sind die antioxidativen Eigenschaften nicht nur auf das Vorhandensein von einer Vielzahl von
Sulfhydrylgruppen, die reaktive Sauerstoffspezies reduzieren können, sondern auch auf die Metallbindung zurückzuführen. MT können den zytosolischen Gehalt redoxaktiver Metalle verringern und auch so die Synthese reaktiver Sauerstoffspezies mindern. Wie für metall-behandelte Kulturen mehrfach gezeigt werden konnte, wird auch die Expression der MT transkriptionell reguliert. Neben metal response elements (MRE) besitzt der Promotor von MT-Genen der Vertebraten auch antioxidant response elements (ARE) (Viarengo et al., 2000). Auch S. pombe zeigte eine verstärkte Transkriptakkumulation nach H2O2-Behandlung Abb. 3.14-1). Dieses Ergebnis konnte auch durch die von Chen und Ko-Autoren durchgeführten Microarrayuntersuchungen bestätigt werden (Chen et al., 2003);
(http://www.sanger.ac.uk/perl/SPGE/geexview?group=2&q=SPAC22H10.13). Hier konnte eine etwa 60fache Transkriptakkumulation des zym1 nach H2O2-Behandlung gezeigt werden.
In der vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob die verstärkte Transkriptakkumulation auch mit einer erhöhten Synthese des Genproduktes einhergeht. Zym1 könnte die toxischen Effekte reaktiver Sauerstoffspezies mindern. Daher sollte untersucht werden, ob ∆zym1 sensitiver gegenüber oxidativen Streß reagiert. Die Kulturen von Wildtyp und ∆zym1 wurden mit H2O2 behandelt und ihr Wachstum nach Streßapplikation ermittelt.
Wildtyp und ∆zym1 Mutante zeigten beide ein um ca. 15 % reduziertes Wachstum nach H2O2 -Behandlung (Abb. 3.15-1). Es konnten demnach keine Unterschiede zwischen den beiden Stämmen ermittelt werden. Beide Stämme reagierten vergleichbar sensitiv auf den oxidativen Streß. Eine Funktion des MT innerhalb der Streßantwort kann daher ausgeschlossen werde.
Unklar bleibt allerdings, warum H2O2 die höchste Induktion auf mRNA-Ebene hervorruft (Abb. 3.14-1). Inwiefern die zym1 Transkriptakkumulation Einfluß auf die Synthese von Zym1 hat, konnte ebenfalls nicht geklärt werden. Die Expression des Zym1-HA zeigte eine leichte Reduktion gegenüber Kontroll- und metallbehandelten Proteinextrakten (Abb. 3.11-1).
Allerdings ist pSLF172/zym1 unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors, der nicht durch oxidativen Streß induziert wird, exprimiert. Die unter Kapitel 3.11 durchgeführten Untersuchungen könnten höchstens Aufschluß über den turnover des Proteins geben. Da zym1 eine 60fach gesteigerte Transkriptakkumulation aufweist, aber kein verändertes Wachstum der ∆zym1 Mutante im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden konnte, kann spekuliert werden, daß Zym1 einem schnellen Abbau unterliegt.
Eine weitere Erklärung könnte in der Metallbindung des Zym1 liegen. Es konnte nachgewiesen werden, daß in Hefen Cu-gesättigte MT mehr als Zn- und Cd-bindende MT an der Detoxifizierung reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt sind (Tamai et al., 1993). Da nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, ob Zym1 ein Cu-MT ist und da es Hinweise auf
Zinkbindung gibt, soll diese Möglichkeit der Interpretation der Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden (Borrelly et al., 2002). Sollte Zym1 wirklich ein zinkbindendes MT sein, so könnte diese mit einem starkem Verlust der antioxidativen Wirkung einhergehen.