Spektroskopische und spektrometrische Methoden

Aus den ermittelten Löslichkeiten ließen sich die freien Transferenergien der Aminosäuren von Wasser in 1 M Additiv berechnen (siehe Kapitel 2.2.4.7). Für Tyr und Trp wurde zumeist auf eine Messung von Dichten verzichtet. Stattdessen wurde die Tyr- bzw. Trp-Konzentration mittels UV/Vis-Absorptionsspektroskopie bestimmt.

Dafür wurden für Tyr und Trp spezifische Extinktionskoeffizienten von 7,0644 cm² mg^-1 bzw.

27,861 cm² mg^-1 verwendet (Gill und von Hippel, 1989). Alle Messungen wurden pufferkorrigiert.

2.2.4.7 Berechnung der freien Transferenergien aus Löslichkeitsmessungen

Aus Löslichkeitsmessungen von Proteinen oder einzelnen Aminosäuren lassen sich die Effekte von Additiven über die Berechnung der Veränderung der freien Transferenergien vom Feststoff zum gelösten Zustand (ΔG_Transfer) quantifizieren. So ist es möglich festzustellen, ob der Transfer einer Komponente in eine Lösung mit Additiv vorteilhaft ist oder nicht. Die Veränderung der freien Transferenergie ergibt sich wie folgt:

Gleichung 2.3 Hierbei ist R die universelle Gaskonstante in J mol^-1 K^-1, T die Temperatur in K, S die gemessene Löslichkeit in Anwesenheit und S₀ die Löslichkeit in Abwesenheit des Additivs. Die Löslichkeiten wurden stets als Molalitäten (mol kg^-1 Lösung) in Gleichung 2.3 eingesetzt.

Als Referenzlöslichkeiten wurden die von Liu und Bolen (1995) in Wasser gemessenen Werte verwendet (siehe Anhang, Tab. 6.8).

Molare Extinktionskoeffizienten für denaturierte Proteine lassen sich nach Gleichung 2.5 aus der Anzahl der Trp ( ), Tyr ( ) sowie Cystine ( ) berechnen (Gill und von Hippel 1989).

Gleichung 2.5 Die molaren Extinktionskoeffizienten wurden für tc-rPA, CM-rPA, Tyr bzw. Trp auf das jeweilige Molekulargewicht bezogen und sind in Tab. 2.9 aufgeführt.

Tab. 2.9: Verwendete Extinktionskoeffizienten Protein/Substanz Extinktionskoeffizient (cm² mg^-1)

rPA/tc-rPA 1,704

CM-rPA 1,676

Trypsin 1,29

BSA 0,667

Tyr 7,064

Trp 27,861

Für die Quantifizierung mittels UV/Vis-Absorptionsspektroskopie wurden üblicherweise geschwärzte Ultra-Mikro-Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm verwendet. Alle gemessenen Extinktionen wurden pufferkorrigiert.

2.2.5.2 Refraktometrische Bestimmung von GuHCl-, EMIMCl-, EMIMDEP- und L-ArgHCl-Konzentrationen

Die Konzentration von wässrigen GuHCl-, EMIMCl-, EMIMDEP- und L-ArgHCl-Lösungen wurde mit Hilfe eines Refraktometers und folgender empirisch ermittelter Gleichungen bestimmt:

Gleichung 2.6^* Gleichung 2.7

Gleichung 2.8

Gleichung 2.9 *aus Nozaki, 1972

2.2.5.3 Streulichtmessungen

Die Konzentrationsabhängigkeit der Aggregation in L-ArgHCl und EMIMCl wurde an einem Fluoromax 3 Spektrofluorimeter (Horiba Jobin Yvon Inc., Edison, NJ) untersucht. Alle Messungen wurden bei 20 °C mit einer Fluoreszenzküvette mit Sternrührer durchgeführt. Die Anregungs- und Emissionswellenlänge betrug jeweils 600 nm.

Die bei den Messungen verwendeten Puffer wurden unmittelbar vorher gefiltert, Proteinlösungen wurden abzentrifugiert (150.000 × g für 20 min bei 4 °C).

Die Aggregation von rPA, dr-rPA, CM-rPA und tc-rPA wurde durch 1:22 Verdünnung in Puffer mit 100 mM Tris/HCl, pH 8,5 oder 100 mM Borsäure/NaOH, pH 8,5, 1 mM EDTA und entsprechenden molaren Konzentrationen an EMIMCl bzw. L-ArgHCl initiiert. Die Messung der Aggregation von dr-rPA erfolgte in Gegenwart von 10 mM DTT, um eine Aggregation durch kovalente Disulfidverbrückung zu vermeiden.

Aus den gemessenen Aggregationskinetiken wurden die Anfangsanstiege ermittelt und doppelt logarithmisch gegen die Proteinkonzentration aufgetragen. Aus dem Anstieg einer solchen Auftragung lässt sich die apparente Ordnung einer Reaktion bestimmen.

Dies ist möglich, da für eine Reaktion der Form

nA B

folgende Gesetzmäßigkeit gilt:

Gleichung 2.10

Hierbei ist die initiale Änderung des Lichtstreusignals, k die Geschwindigkeitskonstante für die Aggregation, A₀ die Proteinkonzentration zu Beginn des Aggregationsprozesses und n die apparente Reaktionsordnung. Durch ein Logarithmieren von Gleichung 2.10 erhält man eine Geradengleichung mit dem Anstieg n:

Gleichung 2.11 Dies gestattet eine Berechnung der apparenten Reaktionsordnung für die Aggregation.

2.2.5.4 Circulardichroismus

Circulardichroismus-Spektren und Kinetiken wurden im Nah-UV-Bereich (260 – 340 nm) an einem Jasco J-810 Spektropolarimeter bei 20 °C gemessen. Die gemessene Elliptizität Θ (in mdeg) wurde pufferkorrigiert und nach Gleichung 2.12 auf die molare residuelle Elliptizität

Θ (in deg cm² dmol^-1) umgerechnet (Kelly et al., 2005). Dabei ist die mittlere molare Masse einer Aminosäure im Protein (in g mol^-1), die Proteinkonzentration (in mg ml^-1) und die Schichtdicke der Küvette (in cm).

Θ Gleichung 2.12

CD-Signale wurden mittels Photomultiplier detektiert, bei welchem mit sinkender Lichtintensität die Detektionsempfindlichkeit durch Erhöhung der Verstärkerspannung verbessert wird.

Messwerte mit einer Verstärkerspannung von mehr als 600 V wurden nicht ausgewertet.

2.2.5.4.1 Messung von CD-Spektren im Nah-UV-Bereich

Die Messung von Nah-UV-CD-Spektren von tc-rPA in 100 mM Borsäure/NaOH, pH 8,5, 1 mM EDTA und verschiedenen EMIMCl-Konzentrationen erfolgte mit einer Protein-konzentration von 3,4 mg ml^-1 in einer 1 mm Quarzglasküvette. Die Spektren wurden 64 × akkumuliert. Bei den Messungen betrug die Scangeschwindigkeit 100 nm min^-1, die Schrittweite 0,2 nm, die Integrationszeit und die Bandbreite jeweils eine Sekunde. Die CD-Spektren wurden um die CD-Signale des entsprechenden Dialysepuffers korrigiert.

2.2.5.4.2 Denaturierungsmittel-induzierte Übergänge von tc-rPA im Nah-UV-CD-Bereich Zur Messung von Denaturierungsmittel-induzierten Übergängen von tc-rPA in EMIMCl, EMIMDEP und GuHCl wurde eine konzentrierte tc-rPA-Lösung in 1 mM EDTA, 100 mM Borsäure/NaOH bzw. Tris/HCl, pH 8,5 mit ansteigenden EMIMCl, EMIMDEP bzw. GuHCl-Konzentrationen verdünnt und nach 24 Stunden Inkubation Kinetiken bei λ = 280 nm gemessen. Hierbei wurde für die Messungen in EMIMCl bzw. EMIMDEP eine 0,5 mm Quarzglasküvette und für die Messungen in GuHCl eine 1 cm Makro-Quarzglasküvette verwendet. Jeder Datenpunkt wurde 10 min (für tc-rPA in EMIMCl und GuHCl) bzw.

20 Minuten (für EMIMDEP) akkumuliert und anschließend über die gesamte Zeit integriert. Die Integrationszeit betrug 4 und die Schrittweite 5 Sekunden.

2.2.5.5 Dynamische Lichtstreuung

Die dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde verwendet, um den Oligomerisierungszustand von tc-rPA und CM-rPA in hohen EMIMCl- und EMIMDEP-Konzentrationen zu analysieren.

Weiterhin wurden Aggregationskinetiken gemessen, bei welchen die Proteinkonzentration variiert

wurde, um so Hinweise auf die Reaktionsordnung der Aggregation von tc-rPA und CM-rPA zu erhalten.

Bei der DLS werden Intensitätsfluktuationen im Streulicht analysiert, welche durch die Brownsche Molekularbewegung von Partikeln verursacht werden. Dabei wird mit Hilfe einer Autokorrelationsfunktion g²(τ) der Form (Frisken, 2001)

Gleichung 2.13

die Änderung des Streulichtintensitätsmusters zwischen verschiedenen Zeitpunkten t und t+τ miteinander korreliert. Diese Korrelation klingt mit der Zeit in Abhängigkeit vom Diffusionskoeffizienten der Partikel ab. Aus diesem Abklingen ist es möglich, die intensitäts-gewichtete Partikelgrößenverteilung und den intensitätsintensitäts-gewichteten mittleren hydrodynamischen Partikeldurchmesser (z-Mittelwert, M_Z) zu berechnen. Mit Hilfe der Mie-Korrektur (Mie, 1908) lassen sich anschließend aus der intensitätsgewichteten Partikelgrößenverteilung die volumen-gewichteten und nummernvolumen-gewichteten Partikelgrößenverteilungen berechnen.

Der Zusammenhang zwischen der Partikelgeschwindigkeit und der Partikelgröße ist durch die Stokes-Einstein-Gleichung (Einstein, 1905) gegeben:

Gleichung 2.14

Diese besagt, dass der Diffusionskoeffizient umgekehrt proportional zum hydrodynamischen Radius eines Partikels ist. Dabei ist in Gleichung 2.14 D der Diffusionskoeffizient, kB die Boltzmann-Konstante, T die Temperatur, η die Viskosität der Lösung und r der hydrodynamische Partikelradius.

DLS-Messungen wurden an einem Zetasizer nano S (Malvern Instruments, Worchestershire, Großbritannien) mit Hilfe eines HeNe-Lasers (λ = 633 nm) durchgeführt.

Für die Messung von Aggregationskinetiken von tc-rPA und CM-rPA wurden beide Proteinvarianten aufkonzentriert und anschließend für 48 h bei 22 °C gegen 4,5 M EMIMCl, 1mM EDTA, 100 mM Borsäure/NaOH, pH 8,5 (tc-rPA) bzw. 4 M GuHCl, pH 3 (CM-rPA) dialysiert. Die Konzentrationsabhängigkeit der Aggregation von tc-rPA und CM-rPA wurde durch 1:2,5 Verdünnung (tc-rPA) bzw. 1:10 Verdünnung (CM-rPA) in 6 M EMIMCl, 1 mM EDTA, 100 mM Borsäure/NaOH, pH 8,5 gestartet. Es wurden Kinetiken mit 20 bis 30 Datenpunkten gemessen. Pro Datenpunkt wurden 13 – 16 Messungen mit je 10 Sekunden Messdauer akkumuliert. Alle verwendeten Puffer und die Proteinlösung wurden zuvor bei

Da die Viskositäten der Lösungen nicht exakt messbar waren, wurden sie so eingestellt, dass der erste z-Mittelwert-Datenpunkt mit 5,7 nm dem theoretischen hydrodynamischen Durchmesser eines globulären, 39,5 kDa schweren Proteins entsprach. Für die Aggregationsmessungen von CM-rPA in EMIMCl wurde die Viskosität analog durch Normierung mit tc-rPA in demselben Puffer vorgenommen. Aus der Messung der Konzentrationsabhängigkeit der Proteinaggregation wurde analog zu den Streulichtmessungen (Kapitel 2.2.5.3) die Reaktionsordnung der initialen Aggregationsreaktion bestimmt.

2.2.5.6 Messung von GuHCl-induzierten Übergangskurven mittels Fluoreszenz

Es wurden GuHCl-induzierte Übergangskurven von rPA, tc-rPA und CM-rPA gemessen, um unter anderem den Einfluss der Plasminspaltung auf die Stabilität des Proteins bzw. die Eignung von CM-rPA als Modellsystem für den denaturierten Zustand zu untersuchen. Für die Denaturierung wurden rPA, tc-rPA bzw. CM-rPA vorliegend in 1M L-ArgHCl, 1 mM EDTA, 100 mM Tris/HCl, pH 8,5 bzw. in 4 M GuHCl, pH 3, 1:100 in 1 mM EDTA, 100 mM Tris/HCl und ansteigende Konzentrationen GuHCl verdünnt. Die Ansätze wurden über Nacht bei 22 °C inkubiert. Die Messung der Fluoreszenzemissionsspektren erfolgte an einem Fluoromax 3 – Fluoreszenzspektrometer (Horiba Jobin Yvon Inc., Edison, USA) bei 20 °C. Die Anregungswellenlänge betrug 280 nm, die Spektren wurden von 290 – 440 nm gemessen und dreimal akkumuliert. Die Spaltbreiten für die Anregung und die Emission betrugen 2 und 5 nm bzw. 5 und 5 nm, die Integrationszeit betrug 1 s und die Schrittweite 1 nm. Alle Spektren wurden pufferkorrigiert.

2.2.5.7 Festkörper-NMR Spektrometrie

Festkörper-NMR-Messungen wurden mit präzipitiertem nativem tc-rPA (15 mg), CM-rPA (12 mg) und mit in 5,4 M EMIMCl-denaturiertem tc-rPA (11,5 mg) an einem Avance 750 NMR-Spektrometer (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten) durchgeführt. Hierfür wurden die Proteinproben dreimal bei 4 °C gegen ca. 200 Volumen 1 mM EDTA, 50 mM Borsäure/NaOH, pH 8,5 dialysiert und die Präzipitate anschließend für 10 min bei 16.000 × g und 4 °C abzentrifugiert. Die Proteinpräzipitate wurden in kleine Messröhrchen transferiert. Es wurden

13C-NMR-Spektren aufgenommen. Die CP-MAS (cross polarization – magic angle spinning) – Frequenz betrug 7 kHz. Die Messungen wurden freundlicherweise von Dr. Holger Scheidt (Medizinische Fakultät der Universität Leipzig) durchgeführt.

2.2.5.8 IR-Spektroskopie

ATR-FTIR-Messungen wurden an einem Tensor 27 FTIR-Spektrometer (Bruker Optics GmbH, Karlsruhe) mit einer BioATR II-Zelle durchgeführt. tc-rPA wurde aufkonzentriert und gegen 100 Volumen 4,5 M EMIMCl bzw. gegen 250 Volumen 1 M EMIMCl und 50 mM Borsäure/NaOH, pH 8,5 dialysiert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentrationen wurden ATR-FTIR-Spektren von 4000 – 1000 cm^-1 gemessen. Hierbei wurden 64 Einzelspektren akkumuliert, welche um die Beträge der jeweiligen Dialysepuffer korrigiert wurden. Die Kinetik von tc-rPA in 5,4 M EMIMCl wurde durch 1:2,5 Verdünnung von tc-rPA, vorliegend in 4,5 M EMIMCl in Puffer mit 6 M EMIMCl gestartet. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit der Spektrometersoftware Opus 5.5. Die Messungen wurden freundlicherweise von Dr. Julian Ollesch (Max-Planck-Forschungsstelle für die Enzymologie der Proteinfaltung, Halle) vorgenommen.

2.2.5.9 Massenspektrometrie

Massenspektrometrische Untersuchungen von mittels RP-HPLC entsalzten Proteinproben wurden mittels ESI-Q-TOF-Massenspektrometrie an einem Q-TOF 2 Massenspektrometer (Micromass, Manchester, Großbritannien) durchgeführt. Dies erfolgte freundlicherweise durch Dr. Angelika Schierhorn (Max-Planck-Forschungsstelle für die Enzymologie der Proteinfaltung, Halle).