C 2.2.1 Verdau
Um die nach dem in C 2.1.1.2 vorgestellten Protokoll gewonnene gDNA in einzelne Fragmente mit Längen von ungefähr 2–3 kb aufzuspalten, musste sie einem Verdau mit zwei Restriktionsenzymen unterzogen werden.
Hierzu wurde folgender Ansatz erstellt:
gDNA 1-2 µg gDNA (entspricht ca. 40 µl) Sph I (NEB) 2,5 µl
Hind III 2,5 µl Puffer 2 (NEB) 5 µl _____________________
Gesamt 50 µl
Es folgte ein Inkubationsschritt über 14 h bei 37 °C.
C 2.2.2 Herstellung einer Digoxigenin (DIG)–markierten Sonde
Zur Herstellung der für das anschließende Detektionsverfahren benötigten Sonde wurde eine PCR mit zum Teil DIG-markierten Thymidin durchgeführt.
Der Ansatz für eine Reaktion lautete:
gDNA von E. cloacae # 1919 1 µl dATP (2 mM) 1 µl dCTP (2 mM) 1 µl dGTP (2 mM) 1 µl
dTTP (2 mM) 0,75 µl
DIG-dTTP (25 nmol/µl) 2,5 µl Puffer (10 x) 5 µl Taq-Polymerase 0,25 µl primer forward (100 mM) 1 µl primer reverse (100 mM) 1 µl
H2O 35,5 µl
_____________________________
Gesamt 50 µl
Der Ansatz wurde in einen Thermalcycler eingesetzt, der nach folgendem Schema programmiert war:
Denaturierung 94 °C (5 Min.) 30 Zyklen von:
Denaturierung 94 °C (1 Min.) annealing 55 °C (1 Min.) Elongation 72 °C (2 Min.) Abschließende Elongation 72 °C (7 Min.)
Aufbewahrungsphase 4 °C (kontinuierlich)
Die Reinigung der Sonde erfolgte durch Gelextraktion nach C 2.1.5, wobei ein Gel mit 1 % w/v Agarose, dem „DNA molecular weight marker― VIII von Roche und 50 µl Eluationsvolumen verwendet wurden. Die so erhaltene Sonde wurde bei —20 °C aufbewahrt und musste vor Benutzung zum Southern Blotting noch 10 Min.
aufgekocht sowie unmittelbar anschließend auf Eis gelagert werden, um als DNA-Einzelstränge verfügbar zu sein.
C 2.2.3 Durchführung eines „Dot Blot“
Mittels des „Dot Blot―-Verfahrens wurde die Spezifität und Sensitivität der Sonde überprüft. Zunächst wurden entsprechende, korrespondierende Genabschnitte durch PCR amplifiziert. Die Konzentrationen der entstandenen Amplifikate wurden durch photometrische Messungen nach C 2.1.3 bestimmt. Folgend wurden
definierte Verdünnungen mit 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg sowie 10 pg der PCR-Fragmente in 10 µl H2O erstellt. Je 10 µl der Verdünnungslösungen wurden in einer Reihe pro zu untersuchendem Genabschnitt auf eine positiv geladene
Nylon-membran aufgetragen und dann in einem „UV-Stratalinker― im „Autocrosslinking―-Modus bei 1.200 100 µJoules mit UV-Licht bestrahlt. Dadurch wurden die Proben-DNA auf der Nylonmembran fixiert. Die Membran wurde nun aufgerollt und in ein Falcon-Tube verbracht. Im Rahmen einer „Prähybridisierungsphase― wurden 5 ml Hybridisierungspuffer hinzugegeben. Die Membran inkubierte nun 1 h bei 42 °C.
Während dessen wurde die Sonde wie in C 2.2.2 beschrieben für den Versuch vorbereitet. Nach dem Abgießen des Puffers wurde die in 5 ml Hybridisierungspuffer mit einer Konzentration von 100–200 ng/ml gelöste Sonde zugefügt. Die eigentliche Hybridisierung folgte während einer erneuten Inkubation bei 42 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurde der Überstand mit gelöster Sonde abgekippt und für spätere Versuche bei —20 °C aufbewahrt. Die im Folgenden erwähnten Puffer wurden nach jedem Schritt wieder verworfen. Die „Detektionsphase― begann mit einem ersten Waschschritt, bei dem zweimal mit 5 ml 2 SSC / 0,1 % SDS-Puffer über 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Der anschließend zweifach durchgeführte zweite Waschschritt bestand in einer Inkubation bei 68 °C über 15 Min. mit 5 ml
0,1 SSC / 0,1 % SDS-Puffer. Die folgenden Bebrütungsschritte wurden alle, falls nicht anders vermerkt, bei Raumtemperatur durchgeführt, die dabei verwendeten
Puffer nach den Schritten abgegossen. Zur Verhinderung weiterer, eventuell unspezifischer Sondenbindungen wurde nun die Membran zweimal für 15 Min. mit je 5 ml „Blocking―-Puffer versehen. Um dann den Kernschritt der Antikörperbindung durchzuführen, wurden die Dot-Blots mit 5 ml eines je 1 µl der Anti-Digoxigenin-Antikörper-Lösung von Roche enthaltenden Konjugatpuffers (entsprechend einer Verdünnung von 1:5.000) über 60 Min. behandelt. Nach wiederum zweimaligen Waschschritten über jeweils 15 Min. mit je 5 ml Waschpuffer und nachfolgend der Äquilibration der Blots über 2–5 Min. mit 5 ml des Assay-Puffers konnte schließlich eine Detektionsreaktion durchgeführt werden. Mittels der Erkennungsreaktion sollten die entstandenen Antigen-Antikörperreaktionen sichtbar gemacht werden.
Zunächst wurde 3 ml CSPD/Puffer-Verdünnung (6 µl CSPD in 3 ml Assay-Puffer; entsprechend einer Verdünnung von 1:500) für 5 Min. im Dunkeln
hinzugegeben. Nach Abtropfen wurde das Membranstück in noch feuchtem Zustand in eine Plastikfolie verbracht. Durch die nun stattfindende
Chemilumineszenzreaktion konnte Lichtstrahlung emittiert werden. Als
Verschiebeschutz wurde die Folie mit Klebeband in einer Röntgenkassette fixiert. In der Dunkelkammer wurde ein Röntgenfilm zwischen 15 Min. und 24 h bei 37 °C der Lichtemission ausgesetzt. Der Film wurde an den Stellen geschwärzt, an denen durch die Bindung der Digoxigenin-markierten Sonde eine lichterzeugende Reaktion stattgefunden hatte. Die Schwärzung konnte somit eine eventuell erfolgte Bindung der Sonde an die aufgetragenen PCR-Produkte nachweisen. Nach Entwicklung der Röntgenfilme wurden die Membranen in den Folien bei —20°C eingefroren. Für erneute Untersuchungen konnten die Blots im Rahmen des sogenannten „Blot-Strippens― für erneute Untersuchungen wiederaufbereitet werden. Zur Ablösung der Sonde wurde die Membran für 10 Min. in aufgekochtem 0,1 %igem SDS inkubiert.
Eine Kontrolle für die noch auf der Blot-Membran haftende DNA konnte mit einer Methylenblaufärbung gemacht werden. Vor erneuter Hybridisierung eventuell noch gebundene „alte― Sonde musste mittels einer erneuten, wie oben beschrieben
durchgeführten Detektion ausgeschlossen werden. Dem Vorgehen lagen Beschreibungen im „DIG Application Manual for Filter Hybridization― von Roche Molecular Biochemicals zugrunde.
C 2.2.5 Durchführung eines Kapillarblots
Abb. 5: Apparatur für Kapillarblot
Das zu blottende Gel wurde auf eine mit Transportpuffer getränkte Papierbrücke gelegt. Auf dem Gel wurde eine Nylonmembran platziert. Den oberen Abschluss bilden Filterpapiere und Einmalhandtücher aus Papier, durch deren Sogwirkung Puffer mit zu blottenden DNA-Fragmenten vom Gel auf die Membran gebracht wird. Die Fixierung der Apparatur erfolgte mittels an Stangensystemen befestigter Bechergläser. (vgl. Text, Abbildung 6)
Die hierbei vollzogenen Wasch-, Konjugations-, Blockierung- und
Entwicklungsschritte gleichen den in C 2.2.4 beschriebenen Vorgängen. Der Unterschied besteht nur darin, dass jetzt nicht direkt die nachzuweisenden DNA-Lösungen auf die Membran aufgebracht werden, sondern die mittels einer bestimmten Kombination von Restriktionsenzymen fragmentierten und durch Gelelektrophorese aufgetrennten DNA der zu untersuchenden Bakterien. Der
erwähnte Restriktionsverdau erfolgte nach Punkt C 2.2.1. Die erhaltene, nun in Stücken mit je circa 2 bis 3 kbp Länge vorliegende bakterielle DNA musste darauf noch in einem Agarosegelelektrophoreseschritt (vgl. C 2.1.4) aufgetrennt werden.
Damit später auf dem Röntgenfilm auch ein Größenstandard sichtbar war, wurde in der elektrischen Auftrennung 50 µg des Digoxigenin-markierten „DNA molecular weight markers― III der Firma Roche/Böhringer verwandt. Als Vorbereitungsschritte für den Blot wurden die Gele daraufhin zunächst 20 Min. mit vorbereitetem
Denaturierungspuffer bedeckt und bei Raumtemperatur mäßig geschüttelt. Die Agarosegele wurden für 20 Min. in Neutralisierungspuffer und bei Raumtemperatur ebenfalls unter geringem Schütteln bebrütet. Nun wurde der im obigen Foto (vgl.
Abbildung 5) dokumentierte Aufbau zur Durchführung des eigentlichen Kapillarblots wie nachfolgend beschrieben aufgebaut. Zunächst wurde ein ausreichend großes Styroporbehältnis circa 1 cm hoch mit Transportpuffer befüllt. Eine quaderförmige Plastikschale wurde in der Mitte des Behälters mit dem Boden nach oben platziert.
Als Leitungsmedium für den Puffer wurden vier Filterpapierstreifen von der Breite eines Gels und ausreichender Länge so auf die Plastikschale gelegt, dass die beiden überhängenden Enden des Papiers in die Flüssigkeit eintauchten. Hierbei war darauf zu achten, dass zum einen die Streifen vorher in 20 SSC getränkt wurden und zum anderen zwischen ihnen beim Auflegen keine Luftblasen zurück blieben. Das nach obiger Anleitung vorbereitete Gel wurde mit der Auftragungsseite nach unten auf die Konstruktion gesetzt. Darüber wurde die in H2O getränkte positiv geladene Nylonmembran gelegt, auf welche die DNA gesogen werden sollte. Den Abschluss nach oben bildeten vier weitere Lagen getränkten Filterpapieres gefolgt von einem ausreichenden Stapel saugfähiger Papiertücher. Um zu verhindern, dass durch Überlappung Flüssigkeit an Gel oder Membran vorbei transportiert wurde, waren zum einen diese beiden Schichten mit den Abmaßen eines Gels geschnitten und zum anderen Membran und Gel durch das seitliche Anbringen von
Parafilmstreifen gesichert. Auch mussten die Papiertücher zum Aufbau der
Sogwirkung trocken sein. Zur Verhinderung etwaiger Instabilitäten dieses Aufbaus wurde, wie auf dem oben angefügten Foto illustriert, die gesamte Apparatur mithilfe eines an einem Metallständer befestigten Messkolbens eingespannt. Ein Schema des beschriebenen Aufbaus zeigt Abbildung 6.
Abb. 6: Schema Aufbau Kapillarblot
Auf ein mit Transportpuffer getränktes Filterpaper wurde das zu blottende Gel gelegt. Eine Nylonmembran wurde über dem Gel platziert. Nach oben hin abschließend wurden Filterpapiere und Papiertücher angefügt. Die Sogwirkung der Papiere beförderte Puffer mit zu blottenden DNA-Fragmenten vom Gel auf die Membran. (vgl. Text, Abbildung 5)
Geblottet wurde über Nacht bei Raumtemperatur. Währenddessen wurden die DNA-Fragmente einschließlich des Größenstandards auf die Membran transferiert. Am nächsten Tag wurde die DNA mittels des „UV-Stratalinker― im Autocrosslinking-Modus bei 1200 100 µJoules mit UV-Licht auf der Nylonmembran fixiert. Die aufgerollte Membran wurde in ein 50 ml Falcon-Tube gegeben. Die folgenden
Schritte glichen den bereits unter C 2.2.4 „Durchführen eines Dot-Blots― ab dem Stichwort „Prähybridisierungsphase― erwähnten. Das beschriebene Vorgehen basierte auf dem „DIG Application Manual for Filter Hybridization― von Roche Molecular Biochemicals.
C 2.3 Klonierung
C 2.3.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen
Zuerst mussten sowohl 10 % Glycerin als auch H2O in ausreichender Menge eisgekühlt vorbereitet werden. Der erste Schritt zur Herstellung elektrokompetenter Zellen für die nachfolgenden Schritte der Transformation mittels Elektroporation begann damit, dass aus einer frischen Übernachtkultur der gewünschten Bakterien eine Kolonie in 100 ml LB-Medium überimpft wurde. Diese Flüssigkultur wurde dann kurzfristig mittels Photometerproben in ihrem Wachstum unter Schütteln bei 37 °C überprüft. Als die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 578 nm 0,5 erreicht hatte, wurde die Bakterienkultur für 20 Min. auf Eis platziert. In vorbereitete 2ml-Cups wurden die Bakterien aus 2 ml der Zellsuspension bei 4.500 U/min
abzentrifugiert. Der Sammelschritt wurde unter Verwerfen des jeweiligen
Überstandes zweimal wiederholt, so dass das Pellet von 6 ml der Bakterienkultur zur Weiterverarbeitung genutzt werden konnte. Es folgte ein zweifacher
Waschschritt der Pellets mit je 2 ml kaltem H2O und ein einfacher mit 1 ml 10 % Glycerin. Nach jedem der Waschvorgänge musste kurz zentrifugiert und der
Überstand verworfen werden. Zur Aufbewahrung der so gewonnenen Zellen wurden zu den Bakterienpellets 40 µl 10 %iges kaltes Glycerin hinzugefügt. Das Cup wurde bei —80 °C kryokonserviert (vgl. Dower et al, 1988 46).
C 2.3.2 Isolierung von Plasmiden
Damit gewünschte Plasmide schnell und zuverlässig für weitere Verarbeitung zur Verfügung gestellt werden konnten, wurden Kits der Firma QIAGEN (Nucleospin
Plasmid Quick Pure) zur Plasmidisolierung genutzt. Die Vorgehensweise folgte den beiliegenden Handbüchern.
C 2.3.3 Verdau
Zur Subklonierung von PCR-Produkten wurden die Plasmide mit entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut. Für beide folgenden Vorgehensweisen
(Restriktionsanalyse, Restriktionsverdau) wie auch bei Verwendung von zwei Enzymen gleichzeitig wurden die Reaktionsbedingungen wie Bebrütungszeit, Puffer und Addition von BSA entsprechend den Herstellerangaben gewählt.
Restriktionsanalyse:
Plasmid-DNA 1–2 l
Enzym 1 l (5–10 Units)
Buffer 1 l
BSA (optional) 1 l
H2O 10 l
Endvolumen 10 l
Inkubationszeit 1 h
Restriktionsverdau:
Plasmid-DNA 10–20 l
Enzym 1–3 l (30–40 Units)
Buffer 1–3 l
BSA (optional) 1–3 l
H2O X l
Endvolumen 2030 l
Inkubationszeit 1,5 h
An die Restriktionsschritte schloss sich zur Erfolgskontrolle eine Auftrennung der gewonnenen Fragmente mittels Agarosegel wie in Abschnitt C 2.1.4 beschrieben an.
C 2.3.4 Alkalische Phosphatase-Reaktion („Cip-en“)
Um zu verhindern, dass die geschnittenen Plasmidenden im unmittelbaren Anschluss wieder religierten, wurden mit Hilfe von De-Phosphatierung die beiden aufgetrennten Enden des Vektors geschützt werden. Hierzu wurden die 30 l eines Plasmidrestriktionsansatzes (Gewinnung siehe C 2.3.3) mit 2 l der alkalischen Phosphatase („CIP―) mit 2 l Puffer 2 (beides von NEB) und 16 l H2O versetzt und zunächst eine halbe Stunde bei 37 °C bebrütet. Es wurden nochmals 1 l CIP hinzugegeben und bei 37 °C eine weitere halbe Stunde inkubiert. Das Ergebnis wurde nach Reinigung mittels des Qiaquick PCR Purification Kits nach
beiliegendem Handbuch aufgereinigt und zur Aufbewahrung bei —20°C eingefroren.
C 2.3.5 Ligation
Folgende Zusammensetzung des Reaktionsansatzes wurde zur Ligation des mit alkalischer Phosphatase behandelten, mit Restriktionsenzymen geschnittenen Vektors mit dem gewünschten, aufgereinigten Insert verwendet:
Vektor X l
Insert Y l
T4-Ligase (NEB) 1 l
T4-Ligase-Puffer (NEB) 1,5 l
Endvolumen 15 l
Der eigentliche Ligation fand über Nacht bei 16 °C in einem Thermoblock statt. Zum Anhalten der Reaktion wurde die Probe für 10 Minuten bei 70 °C gehalten, wodurch die T4-Ligase inaktiviert wurde und somit eine bessere Ausgangsposition für die folgende Transformation gefunden wurde. Das Reaktionsgefäß wurde anschließend auf Eis aufbewahrt.
C 2.3.6 Transformation in elektrokompetente Zellen
Zuerst wurden die wie unter C 2.3.1 beschrieben gewonnenen elektrokompetenten Zellen vorsichtig auf Eis aufgetaut. Im Versuchsansatz für diesen Schritt wurden zuerst 40 l der Zellsuspension und folgend 1–2 l des Ligationsansatzes aus C 2.3.5 oder einer Plasmid-Minipreps in eine Elektroporationsküvette gegeben. Die Küvette musste für diesen Schritt ebenfalls eisgekühlt sein. Mit einem auf 2,5 V justierten „GenePulser― wurde die Transformation durchgeführt. Der
Reaktionsansatz wurde unter Schütteln und mit 1 ml LB-Medium vermengt eine
Stunde lang bei 37 °C bebrütet und dann auf Agar ausplattiert. Der genutzte Agar enthielt zur Selektionierung der korrekten Transformanten das jeweils
entsprechende Antibiotikum. Als weiteren Überprüfungsschritt wurden die erhaltenen Klone durch Restriktionsanalyse oder Sequenzierung überprüft. Bei Restriktionsanalysen konnte anhand unterschiedlicher Schnittmuster der
Restriktionsenzyme die Orientierung der ligierten DNA-Abschnitte unterschieden werden. Bei Sequenzanalysen wurde mit geeigneten Primern die richtige Abfolge und Orientierung der inserierten Fragmente dokumentiert.
C 2.3.7 TOPO-Cloning (Subklonierung von PCR-Produkten)
Für Versuche mit Subklonierung von PCR-Produkten wurde der Vektor pCR4-TOPO von Invitrogen, Karlsruhe genutzt. Der Versuchsablauf orientierte sich am Handbuch des Herstellers („TOPO TA Cloning for Sequencing Version K―). Dabei wurden 4 l der gewünschten PCR-Fragmente mit 0,5 l des gebrauchsfertigen pCR4-TOPO-Vektors den Herstellerrichtlinien folgend ligiert und in ebenfalls bereitgestellte E. coli OneShot TOP10-Zellen übertragen. Für das Verständnis der Funktionsweise dieses Vektors ist wichtig, dass er am 3‘-Ende Thymin als Überhang mit daran kovalent gebundener Topoisomerase besitzt. So können mit Adenin-Überhängen des einzubringenden PCR-Fragments effizienter subkloniert werden.