Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute Φ ∆ der Flavine

Um zweifelsfrei den Beweis zu f ¨uhren, dass UVA-Sch¨aden im Gewebe von Singu-lett-Sauerstoffstammen k ¨onnen, ist es notwendig, dass die endogenen

Photosensibi-Kapitel 10. Messung bei der Anregungswellenl¨ange von 355 nm

lisatoren Singulett-Sauerstoffmit einer gewissen Effizienz generieren. Die Effizienz der Singulett-Sauerstoff-Erzeugung wird durch die Singulett-Sauerstoff-Quanten-ausbeuteΦ∆beschrieben.

In der Haut ist der Sauerstoffdruck kleiner als 20 mmHg Quecksilbers¨aule (Ge-sicht, [BES87]). Dies entspricht etwa einer Konzentration von 36 µM an Sauerstoff in L ¨osung. Bei Lufts¨attigung betr¨agt der Sauerstoffdruck in w¨assriger L ¨osung etwa 150 mmHg Quecksilbers¨aule bzw. 270µM. Deshalb ist es notwendig die Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute Φ_∆ auch bei niedrigen Sauerstoff-Konzentrationen zu bestimmen.

10.2.3.1 Direkte Bestimmung vonΦ_∆am Beispiel Riboflavin

Nach Gleichung (3.38) l¨asst sich die Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute Φ_∆ di-rekt bestimmen. Aus der Literatur ist die Triplett-Quantenausbeute f ¨ur Riboflavin in H₂O bekannt zuΦ_T1 =0,61 [CMS88] undΦ_T1 =0,375±0,05 [IPH03]. Der Anteil f_∆^T1 an T₁-Zust¨anden, die durch die Wechselwirkung mit Sauerstoffdeaktiviert werden und dabei Singulett-Sauerstofferzeugen, liegt zwischen 0,25 und 1 [SS01], abh¨angig von der Triplett-Energie E_T1 und der Polarit¨at des L ¨osungsmittels. Mit den Raten K_T1 und k_T1∆ + k_T1O2, welche in Abschnitt 10.2.2 bestimmt worden sind, l¨asst sich P_T1, der Anteil der T₁-Zust¨ande die durch die Wechselwirkung mit Sauerstoffrelaxieren (siehe Gleichung (3.41)), ermitteln.

In Abbildung 10.12 ist der Verlauf vonΦ∆ und PT1 in Abh¨angigkeit von der Sauer-stoffkonzentration dargestellt. PT1 beginnt f ¨ur [O2] bei 0 und steigt bei zunehmender Sauerstoff-Konzentration an. F ¨ur [O₂] −→ ∞ n¨ahert sich P_T1 =1 an. Die einzelnen Werte wurden auf Basis der Messwerte von Abbildung 10.10 berechnet.

Da sowohlΦ_T1 als auch f_∆^T1 nicht eindeutig bekannt sind, l¨asst sich der Verlauf der Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute Φ_∆ nur f ¨ur den schraffierten Bereich (Abbil-dung 10.12) angeben.Φ_∆,maxentspricht dabei dem Verlauf der maximalen Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute, welche mit der Triplett-Quantenausbeute Φ_T1 = 0,61 und f_∆^T1 = 1 bestimmt wurde. F ¨ur Φ_∆,min wurde die Triplett-Quantenausbeute Φ_T1

= 0,375 verwendet und f ¨ur f_∆^T1 wurde f_∆^T1 = 0,25 angenommen. Der Verlauf von Φ_∆ entspricht dem Verlauf von P_T1, reduziert um die Faktoren Φ_T1 und f_∆^T1. Bei Lufts¨attigung (270µM) variiertΦ∆von 0,59±0,05 bis 0,09±0,02. Bei einer Sauerstoff-Konzentration von 36µM betr¨agt die Singulett-Sauerstoff-QuantenausbeuteΦ∆von Riboflavin 0,50±0,04 im Maximum und 0,07±0,02 im Minimum.

Leider ist eine genauere Bestimmung von Φ_∆, bez ¨uglich Riboflavin nicht direkt

10.2. Generierung von Singulett-Sauerstoffdurch endogene Photosensibilisatoren

0 50 100 150 200 250

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

P

Φ

Sauerstoff-Konzentration [µM]

P ,Φ ∆Τ1

Φ

Abbildung 10.12: Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute Φ∆ und PT1 von Riboflavin in H2O versus der Sauerstoff-Konzentration. Schwarze Rechtecke: Einzelne Messungen zu P_T1. Kreis:Φ_∆ indirekt bestimmt nach Abschnitt 10.2.3.2.

m ¨oglich. Deshalb soll im folgenden AbschnittΦ_∆ indirekt bestimmt werden.

10.2.3.2 Indirekte Bestimmung vonΦ_∆

Mit Hilfe eines bekannten Photosensibilisators mit bekannter Singulett-Sauerstoff-QuantenausbeuteΦ_∆ ist es m ¨oglich,Φ_∆des unbekannten Photosensibilisators, ¨uber einen Vergleich der Lumineszenzenergien, zu bestimmen (vgl. Abschnitt 3.7.2). Dazu muss f ¨ur beide Photosensibilisatoren die Energie der Lumineszenz (Integral des Lu-mineszenzsignals ¨uber die Zeit) bei unterschiedlicher absorbierter Laserleistung be-stimmt werden. Das Verh¨altnis der Steigungen der Energie der Lumineszenz gegen die absorbierte Laserenergie ist dann gleich dem Verh¨altnis der Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeuten (siehe Gleichung (3.52)).

In Abbildung 10.13 ist die Energie der Lumineszenz gegen die absorbierte Laser-energie f ¨ur PNS und verschiedene Flavine aufgetragen. Der absorbierte Anteil des Laserlichtes (siehe Tabelle 10.1 dritte Spalte) bei einer 1 cm dicken K ¨uvette l¨asst sich mit Gleichung (3.54) bestimmen. F ¨ur alle verwendeten Substanzen wurde das L ¨osungsmittel H₂O verwendet und jeweils 4·10⁴Durchg¨ange addiert. Die Referenz-substanz PNS, sowie Riboflavin, FMN und FAD wurden bei einer Konzentration von jeweils 50µM bei Lufts¨attigung untersucht.

In Tabelle 10.1 sind die Ergebnisse der Bestimmung der Singulett-Sauerstoff-Quan-tenausbeuteΦ_∆zusammengefasst. In der ersten Spalte sind die verwendeten

Photo-Kapitel 10. Messung bei der Anregungswellenl¨ange von 355 nm

Abbildung 10.13: Lumineszenzenergie von PNS, Riboflavin, FMN und FAD versus der absorbierten Laserenergie. Die untersuchten L¨osungen hatten eine Konzentration von jeweils 50µM.

sensibilisatoren aufgef ¨uhrt. Die zweite Spalte gibt den Absorptionsquerschnitt der einzelnen Photosensibilisatoren bei 355 nm in H₂O an. Aus dem Absorptionsquer-schnitt l¨asst sich mit Gleichung (3.54) der absorbierte Anteil des Laserlichtes bei einer 1 cm dicken K ¨uvette bestimmen. Dieser Wert bei einer 50µM-L ¨osung ist f ¨ur je-den Photosensibilisator in der dritten Spalte dargestellt. Die absorbierte Laserenergie l¨asst sich aus der tats¨achlich im Experiment verwendeten Laserenergie, multipliziert mit den Werten der dritten Spalte, geteilt durch 100 %, berechnen. Die Steigungen der Graphen aus Abbildung 10.13, sind in der vierten Spalte von Tabelle 10.1 zu se-hen. Nach Gleichung (3.52) ist das Verh¨altnis der Steigungen der Geraden (Energie der Lumineszenz gegen die absorbierte Laserenergie) der einzelnen Photosensibi-lisatoren dabei gleich dem Verh¨altnis der Singulett-Sauerstoff-QuantenausbeuteΦ_∆ der jeweiligen Photosensibilisatoren. Somit l¨asst sichΦ_∆, ausgehend vom bekannten Φ_∆ von PNS [STD94], f ¨ur jedes Flavin bestimmen. Diese so bestimmten Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeuten Φ_∆ sind in der f ¨unften Spalte zu sehen. Es f¨allt auf, dass mit zunehmender Komplexit¨at der Struktur der Flavine (vgl. Abbildung 10.1) Φ_∆ kleiner wird, d.h. die F¨ahigkeit Singulett-Sauerstoffzu generieren abnimmt.

Die Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeuten der endogenen Flavine, insbesondere die von Riboflavin und FMN, sind sehr beachtlich. Im Vergleich dazu hat Photofrin, welches zum Abt ¨oten von Krebszellen eingesetzt wird, bei Lufts¨attigung nur eine Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute von 0,35 [OCO02].

Vergleichen wir nun die erhaltenen Werte mit den Ergebnissen aus Abschnitt 10.2.3.1.

10.2. Generierung von Singulett-Sauerstoffdurch endogene Photosensibilisatoren

Photo- Absorptionsquer- Absorption bei Steigung

sensibilisator schnitt bei 355 nm 1 cm K ¨uvetten- S([O₂]) Φ_∆ 50µM in H₂O in 10⁻¹⁷cm² dicke [%] in w.E.

PNS 2,6±0,2 54±4 0,29±0,03 0,98±0,08^a

Riboflavin 3,6±0,2 66±5 0,16±0,02 0,54±0,07

FMN 3,0±0,2 59±4 0,15±0,02 0,51±0,07

FAD 2,7±0,2 56±4 0,020±0,002 0,07±0,01

Tabelle 10.1:Daten zur indirekten Bestimmung der Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute Φ_∆von Riboflavin, FMN und FAD im Vergleich zu PNS.^a[STD94].

F ¨ur Riboflavin wurde in Abbildung 10.12 die indirekt bestimmte Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute bei [O₂]=270µM eingezeichnet. F ¨urΦ_T1=0,61 und f_∆^T1=1 konnte Φ_∆ von Riboflavin bei Lufts¨attigung direkt zuΦ^direkt_∆ =0,59±0,04 bestimmt werden.

In diesem Abschnitt wurdeΦ∆indirekt zuΦ^indirekt_∆ =0,54±0,07 bestimmt. Dieser Ver-gleich zeigt, dass eine Triplett-Quantenausbeute von etwa 0,61 und f_∆^T1 = 1 (kT1O2

=0) innerhalb der Messgenauigkeit realistische Werte darstellen. Hingegen scheint die Triplett-QuantenausbeuteΦ_T1 =0,375±0,05 zu niedrig zu sein.

Die Ber ¨ucksichtigung des ansteigenden Verlaufs der Singulett-Sauerstoff-Quanten-ausbeute mit der Sauerstoff-Konzentration ist wichtig. So istΦ_∆ von Riboflavin bei einer Sauerstoff-Konzentration von 36µM, wie sie in der Haut herrscht, mitΦ^direkt_∆ = 0,50±0,04 kleiner als bei Lufts¨attigungΦ^direkt_∆ =0,59±0,04. Jedoch ist dies noch ausrei-chend um gen ¨ugend Singulett-Sauerstoffin der Haut zu generieren. Zus¨atzlich ist zu beachten, dass Photosensibilisatoren wie Riboflavin neben Singulett-Sauerstoff (Typ-II-Reaktion) auch Sauerstoff-Radikale (Typ-I-Reaktion) generieren (vgl. Ab-schnitt 3.2). F¨allt die Sauerstoff-Konzentration f¨allt auchΦ_∆ und somit die Effizienz der Singulett-Sauerstoff-Generierung. Folglich steigt der Anteil der Generierung von Sauerstoff-Radikalen nach der Typ-I-Reaktion an. Genau das wurde im Paper von Minami et al. [MSM99] beobachtet. Unter wenig Sauerstoff produziert Riboflavin mehr toxische Stoffe wie z.B. H₂O₂als bei Lufts¨attigung.