Simultane Sequenzierung der epigenetischen Basen in dsDNA

Mit den hier synthetisierten Hairpins sollte es nun möglich sein, alle vier Modifikationen des Cytosin gleichzeitig zu untersuchen.

Nach der Behandlung der DNA, mit einem der erwähnten Restriktionsenzyme und der Ligation des spezifisch entstehenden Überhangs, mit dem entsprechenden Hairpin Oligonukleotid kann die dsDNA zusammengefügt werden. Durch eine Aufteilung der Reaktion in vier Teile und einer folgenden Sequenzierung von mdC, hmdC, fdC bzw. cadC, ist eine simultane Bestimmung der Methylierungsmuster und dem Oxidationsstatus eines dsDNA Abschnitts von Interesse möglich (Abbildung 45).

51 Abbildung 45: Experimenteller Aufbau der Hairpin Methode 1) Verdau genomischer DNA mit einer spezifischen Endonuklease. 2) Ligation der synthetisch erstellten Hairpins mit entsprechendem 5‘-Überhang und damit kovalenter Verbindung der dsDNA. 3) Aufteilen der ligierten DNA in vier unterschiedliche Reaktionen: 4) BS Behandlung; 5) oxBS Behandlung; 6) Umsetzung von fdC mit Hydroxylamin und darauf folgende BS Behandlung; 7) Chemical Modification-Assisted Bisulfite (CAB) Behandlung. 8) Amplifizieren der region of interest, die Einführung der Sequenzieradapter und im Weiteren Schritt eine Multiplex Anreicherung mittels PCR- und ID-tagging. Die Abbildung ist an die Vorlage von Referenz ^[172] angelehnt und erweitert.

Um die Hairpin BS Methode erfolgreich auf die Erkennung von fdC auszuweiten, soll in Vorversuchen ein neues Hydroxylamin „SuperFly“ (SF) 18 an fdC getestet werden, welches von Rahimoff et al. für die Untersuchungen an abasischen Stellen entwickelt wurde (Abbildung 46).^[223]

Abbildung 46: Derivatisierung der Formyl-Gruppe des fdC bzw. des fdU in DNA mit dem Hydroxylamin-Reagenz 18.

Die durch das Hydroxylamin 18 geschützte fdC Modifikation, sollte, wie beim fCAB-seq,^[89] durch Bisulfit nicht mehr deformyliert werden können. Eine weitere Methode, welche durch die Derivatisierung mit dem Hydroxylamin möglich sein sollte, ist eine Variante des TET-assisted BS-seq

52 (TAB-seq).^{[87, 224]} Hier verhindert ein an hmdC gekoppelter Zucker die Umsetzung mit TET1 zu cadC.

Auch das mit dem Hydroxylamin verknüpfte fdC sollte die Oxidation durch TET1 zu cadC verhindern können. Somit würden alle anderen 5-modifizierten Cytosine zu cadC oxidiert, und nur fdC im BS-seq als C ausgelesen werden.

4.3.1. Vorversuche zur Reaktivität von SuperFly mit fdC und fdU

Um zu zeigen, dass das sterisch anspruchsvolle Hydroxylamin 18 fdC binden kann, wurden zeitaufgelöste HPLC Studien zum Umsatz durchgeführt. Eine weitere interessante Modifikation der DNA mit freier Formyl-Gruppe ist das 5-Formyluridin (fdU). Um die beiden Modifikationen und die abasischen Stellen unterscheiden zu können, wurde fdU vergleichend zu fdC untersucht. Die Reaktivität hinsichtlich der abasischen Stelle, für die das Reagenz ursprünglich entwickelt wurde, ist ausreichend untersucht und wurde daher als Positivkontrolle verwendet. Das Reagenz reagiert innerhalb von 40 min quantitativ mit einem Oligonukleotid mit abasischer Stelle.^[223]

Für den Vergleich der Derivatisierungszeiten von fdC und fdU wurden synthetische Oligonukleotide mit der Sequenzen 5‘GTA ATG ZGG TAT G3‘ (Z = fdC bzw. fdU) verglichen, welche von Iacovos Michaelides zur Verfügung gestellt wurden. Die Oligonukleotide wurden mit dem Hydroxylamin Reagenz in einer gepufferten Lösung mit bzw. ohne p-Anisidin als Katalysator inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Reaktionen durch die Zugabe von Aceton und durch Schockgefrieren, mittels flüssigem N2, abgebrochen. Das überschüssige Hydroxylamin reagiert dabei mit dem in großen Mengen zugeführtem Aceton ab und wird somit aus der Reaktion schlagartig entfernt. Damit konnten auch die sehr kurzen Reaktionszeiten von 5 min und 15 min realisiert werden.

Abbildung 47: Zeitaufgelöster Vergleich des Umsatzes vom Hydroxylamin mit fdU und fdC. Die Reaktion wurde bei 37 °C durchgeführt. Die hellblauen Balken zeigen den Umsatz von fdC in Abwesenheit des Katalysators p-Anisidin, die dunkelblauen zeigen den Umsatz von fdC in Anwesenheit des Katalysators. Die gelben Balken zeigen den Umsatz von fdU in Abwesenheit des Katalysators, die dunkelblauen zeigen den Umsatz von fdU in Anwesenheit des Katalysators.

53 Der Umsatz der Reaktion konnte mithilfe von analytischer RP-HPLC nachvollzogen werden, da das gebundene Hydroxylamin Reagenz 18 eine Verschiebung in der Elutionszeit von ca. 2 min verursacht.

Vergleichbar zu der später näher beschriebenen Methode zur Oxidation von hmdC (Abschnitt 5.1.2), wurden die Integrale der Signale verglichen und daraus der Umsatz abgeschätzt (Abbildung 47).

Wie erwartet reagierte auch das sterisch anspruchsvolle Hydroxylamin 18, mit den Aldehyden von fdC und fdU. Im Einklang mit der Literatur ^[225] reagierte das Reagenz dabei sehr viel schneller mit fdU (Vollständiger Umsatz nach 15 min mit Katalysator) als mit fdC (Vollständiger Umsatz nach 4-6 h mit Katalysator). Es wird vermutet, dass dies an der stabilisierten Struktur von fdC liegt.^[225] Der Sauerstoff der Formyl-Gruppe befindet sich räumlich gesehen nahe an der C4 Amin-Gruppe und kann möglicherweise eine Wasserstoffbrückenbindung eingehen. Die fU Base besitzt im Gegensatz dazu keine Möglichkeit eine intramolekulare Wasserstoffbrücke auszubilden. Neben der Bindung von fdC bietet das Hydroxylamin 18 damit die zusätzliche Möglichkeit zwischen fdC, fdU und abasischen Stellen zu unterscheiden.

4.3.2. Ausblick

Mit den hier präsentierten Oligonukleotiden sollte nun, in Verbindung mit dem Hydroxylamin 18, eine akkurate Aussage über die dynamische Symmetrie der DNA-Modifikation mdC und dessen oxidierten Derivate möglich sein. Durch zeitaufgelöste Untersuchungen sollte gezeigt werden können, nach welchen Kriterien die Modifikationen aufrechterhalten bzw. entfernt werden. So lassen sich dynamische epigenetische Muster auf dsDNA während der Zellalterung, der Zellteilung oder der Zelldifferenzierung untersuchen. Auch sollte damit untersucht werden können, ob die Oxidation eines mdCs des sense Strangs Auswirkungen auf den antisense Strang hat und vice versa.

Aktuell wird die Funktionsfähigkeit der hier erfolgreich synthetisierten Hairpin-Oligonukleotide, in Kombination mit dem Hydroxylamin 18, in Sequenzierungsversuchen von Pascal Giehr von der Arbeitsgruppe Epigenetik der Universität des Saarlandes (Prof. Dr. Jörn Walter) getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Ligation der Hairpin-Oligonukleotide mit Schnittfragmenten der korrespondierenden Restriktionsenzyme sehr gut funktioniert. Erste vorläufige Sequenzierungs-Ergebnisse weisen zudem darauf hin, dass mit dem Hydroxylamin 18 eine nahezu vollständige Abdeckung der fdCs erreicht werden konnte. Damit können diese nicht mehr durch Bisulfit deformyliert werden und erscheinen weiterhin als C im BS-Seq.

Neben der Sequenzierungsmethode mit dem Hydroxylamin 18 wurden noch weitere BS-Seq basierte Methoden, zur Sequenzierung von fdC auf ihre Qualität hin überprüft. Zum einen wurde das 2019 entwickelte ACE-Seq untersucht. ^[226] Zum anderen wurde das MAB-Seq ^{[92, 93]} und mit Bodipy ^[227] ein weiteres Hydroxylamin getestet. Jedoch konnte keine dieser Methoden einen vergleichbaren Grad des Schutzes der fdCs erreichen bzw. fdC vollständig umsetzten. Abschließende Ergebnisse und Vergleiche werden in Kürze erwartet.

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5. Wasserlösliches IBX zur Oxidation von