Sequenzierung des POMC-Gens

Nachdem man durch die verschiedenen Reinigungsschritte ein möglichst reines

werden sollte, ein Reaktionsmix nach folgendem Schema hergestellt:

Tabelle 29: Reaktionsmix für Sequenzreaktion der POMC-Fragmente

Reagenzien Menge

75 ng DNA X µl *

1-2 pmol Primer 2 µl **

DMSO 0,7 µl

Aqua dest Auf 12µl auffüllen

* Die Menge der einzusetzenden DNA in µl richtete sich nach der Intensität der DNA-Bande im Agarose-Gel, die optisch mit der Intensität der einzelnen ´low-DNA-mass-ladder´ Banden verglichen wurde und so eine Gewichtsabschätzung der Proben DNA zuließ.

** Für Forward und Reverse Sequenzierung wurden getrennte Ansätze vorbereitet. Zu jedem Reaktionsmix wurde einer der fluoreszenzmarkierten Primer (POMC 3a2 F 700, POMC 3a2 R 800, POMC 3b F 700, POMC 3b R 800) pipettiert.

Jeweils 2,5 µl des Reaktionsmixes teilte man auf vier Tubes auf und gab 1 µl G, A, T oder C des „Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ von Amersham hinzu. Danach mußten die Proben vor Lichteinfall geschützt werden, da die Fluoreszenz-Farbstoffe sehr sensitiv auf Licht reagieren. Die Sequenzreaktion fand in einem Thermocycler der Firma Perkin Elmer bei folgenden Bedingungen statt:

Tabelle 30:Thermocycler Bedingungen für die Sequenzierung der POMC Fragmente Temperatur

Zyklusdauer

POMC 3a2 F700 oder R800 POMC 3b F700 oder R800

3 Minuten 94° C 94°C

30 Sekunden 94° C 94° C

30 Sekunden 58° C 57 ° C

30 Sekunden 70° C 70° C

3 Minuten 72 °C 72 °C

Zykluszahl 25 25

Nach Beendigung der Sequenzreaktion wurde diese durch die Zugabe von 2,5 µl

„Formamid loading dye“ aus dem Amersham Sequenz Kit gestoppt. Die Proben wurden in Aluminiumfolie gewickelt und bei 4° C gelagert bis sie zum Auftragen auf das Sequenzgel wieder benötigt wurden.

2.9.4.1. Herstellung und Vorbereitung des Sequenzgels

Zum Gießen des Sequenzgels wurden zunächst folgende Chemikalien in einem 50 ml Falcon–Tube gegeben und ausgiebig gemischt:

Tabelle 31: Zusammensetzung des Sequenzgels

Reagenzien Menge

Long Ranger 4,5 ml

Urea (Harnstoff) 15,75 g

10x TBE 3,75 ml

HPLC Wasser Auffüllen auf 37 ml Konzentration des Gels 6 %

Nach Filtration des Gemischs und Zugabe der Polymerisationsinitiatoren (37 µl TEMED und 260 µl APS (10 %)) konnte das Gel in die vorbereitete Apparatur gegossen werden.

Diese Apparatur bestand aus zwei 41 cm langen Glasplatten, die durch zwei Abstandhalter derselben Länge in einer Entfernung von 0,25 mm aufeinanderlagen und mittels zweier seitlicher Schraubzwingen fixiert wurden. Durch die Kapillarkräfte angetrieben lief das zwischen die beiden Platten gegossene Gel-Gemisch solange in den Freiraum zwischen beiden Platten und Abstandhalter, bis dieser vollständig von Gel-Gemisch ausgefüllt war. Mit Blasenfängern unterschiedlicher Länge ließen sich Luftblasen, die beim Gießen entstanden waren, aus dem noch nicht auspolimerisierten Gel entfernen.

Am oberen Rand der beiden Glasplatten wurde ein Vorkamm zwischen die Platten eingeführt. Dieser Vorkamm bildete später im auspolimerisierten Gel eine ca. 15 cm lange und 0,5 cm tiefe Geltasche, in die der sogenannte Haifischkamm geschoben werden konnte. Nach einer Auspolimerisierungszeit von 2-3 Stunden wurde die Gelapparatur, insbesondere die Glasplatten, von außen gereinigt und nach Entfernen des Vorkamms und Montage des oberen Puffertanks in den Li-Cor-Sequenzer eingesetzt.

Nach Säuberung der durch den Vorkamm ausgesparten Geltasche mittels einer 50ml Spritze, gefüllt mit 1x TBE, steckte man einen Haifischkamm in den ausgesparten Bereich, der dadurch in 48 Kompartimente geteilt wurde. Der obere und untere Puffertank mußten mit 1x TBE als Laufpuffer gefüllt werden und die Pufferkammerabdeckungen mit dem Sequenzer verbunden werden, um diesen endgültig für Vorlauf und Sequenzlauf einsatzbereit zu machen.

Nachdem der Sequenzer in Punkt 9.4.1. hinsichtlich der Hardwareseite für die Sequenzierung vorbereitet worden war, wurden die Software-Einstellungen vorgenommen. Dazu diente das Programm ´Data-Collection´, ein Unterprogramm der

´BaseImageR-Software´. Mit Hilfe des Befehls ´Auto-Gain´ wurden Unregelmäßigkeiten im Gel auf Softwareebene ausgeglichen und durch die Fokussierung die Meßeinheit des Sequenzers justiert. Anschließend startete man einen mindestens 30 Minuten dauernden Vorlauf, durch den das Sequenzgel von Verunreinigungen befreit wurde. Der Vorlauf wurde mit den selben Einstellungen wie die spätere Sequenzierung durchgeführt (Tabelle30).

Während des Vorlaufs hatte man die Möglichkeit, bei, eventuell durch Verschmutzung verursachter, herabgesetzter Bildqualität die Position der Gelapparatur in einem vorgegebenen Maß zu verändern, um so die Qualität der Datenmessung zu verbessern.

Nach Beendigung des Vorlaufs konnten die Proben in die durch den Haifischkamm begrenzten Taschen gefüllt werden. Dabei applizierte man in der Reihenfolge Guanin, Adenin, Thymin, Cytosin jeweils 1µl Probe in jede Tasche. Für jede zu analysierende DNA-Sequenz benötigte man somit 4 Taschen.

Möglichst schnell nach Beladung des Gels wurde die Sequenzanalyse mit folgenden Parametern, die man auch für den Vorlauf verwendete, gestartet:

Tabelle 32: Li-cor Einstellungen zur Sequenzierung

Parameter Einstellung

Spannung 1500 Volt

Stromstärke 37 mAmpere

Power 40 Watt

Heater 50° Celsius

Scan speed 3

2.9.4.3. Auswertung und Datensicherung

Nach 8-10 Stunden waren die Daten für die Sequenzanalyse vom Sequenzer gesammelt worden und konnten mit dem Programm ´Data-Analysis´, Bestandteil der

´Base ImageR Software´, ausgewertet werden. Hier gab es die Möglichkeit, eine DNA-Sequenz, bestehend aus vier Lanes (G, A, T, C), vom Computer automatisch

Bilds nachzuvollziehen. Damit der Computer die automatische Analyse durchführen konnte, mußte man zunächst definieren, in welcher Lane welche Base zu erwarten war.

Mit der ´Band-spacing Funktion´ legte man den Abstand zwischen zwei Basen fest.

Nachdem man die Startbase festgelegt hatte, detektierte der Computer von dieser Base an die Sequenz so lange, bis entweder das Ende des Template erreicht war, die schlechte Qualität kein Fortsetzten des Detektierens zuließ oder der Benutzer die Detektion stoppte. Die ermittelte Sequenz wurde als ´SCF-File´ ausgedruckt und auf CD-Rom mittels eines CD-Brenners gesichert.

Die Auswertungen sowohl der SSCA-Gele als auch der Sequenzierungen wurde jeweils von zwei Personen durchgeführt. Während bei den SSCA-Gelen die beiden Personen unabhängig voneinander die Banden der Gele befundeten, wurde bei den Sequen-zierungen gegengelesen, d.h. eine Person las die von der Licor-Sequencer-Software detektierte Basensequenz vor und überprüfte dabei, ob die Licor-Sequencer-Software die stärkste Bande erfaßt hatte, während die andere Person dies mit der Orginalsequenz, die von Takahashi veröffentlicht wurde, verglich. Dadurch werden sowohl systematische Fehler (z.B. durch die Computersoftware) als auch zufällige Fehler (ein einzelner Auswerter kommt beim Vergleichen durcheinander) vermieden. Nachdem die Ergebnisse der SSCA nach der ersten Auswertung in den Computer eingegeben und ausgedruckt worden waren, wurde dieser Ausdruck erneut durch zwei Personen kontrolliert. Bei fraglichen Auswer-tungen wurde eine qualifizierte dritte Person zu Rate gezogen, um das Ergebnis zu objektivieren