Nach der erfolgreichen funktionellen Charakterisierung der löslichen Anti-Quin scFv’s durch indirekten und indirekt kompetitiven ELISA sowie durch „Western-Blot“ Analyse erfolgte die Sequenzierung und nachfolgende Analyse der verschiedenen scFv-Gene im pIT-Vektor unter Verwendung der spezifischen Sequenzierungsprimer pHEN und LMB3 (siehe 2.2.2).
Die Analyse der erhaltenen Sequenzdaten erfolgte mit Hilfe verschiedener Internetsequenzdatenbanken und den Spezialprogrammen Vector-NTI und Lasergene. Nach Auswertung und anschließendem Vergleich der Sequenzen aller drei Quinmerac bindenden scFv-Klone B11, C11 und H12 konnte eine 100%ige Übereinstimmung der Nukleotidsequenz der Anti-Quin-scFv B11 und C11 festgestellt werden. Im Folgenden wurden daher nur die Sequenzen des Klones B11 und die des Klones H12 in die weiteren Analysen einbezogen (Vergleich Abbildung 18/19/20).
MW (kDa) 50,8
37,6
28
25,4
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 GGC CCA GCC GGC CAT GGC CGA GGT GCA GCT GTT GGA GTC TGG GGG AGG 49 CTT GGT ACA GCC TGG GGG GTC CCT GAG ACT CTC CTG TGC AGC CTC TGG 97 ATT CAC CTT TAG CCG TTA TCC TAT GCG GTG GGT CCG CCA GGC TCC TGG 145 GAA GGG GCT GGA GTG GGT CTC AGC TAT TAG TGG TAG TGG TGG TAG CAC 193 ATA CTA CGC AGA CTC CGT GAA GGG CCG GTT CAC CAT CTC CAG AGA CAA 241 TTC CAA GAA CAC GCT GTA TCT GCA AAT GAA CAG CCT GAG AGC CGA GGA 289 CAC GGC CGT ATA TTA CTG TGC GAA ACC TGG GCC GTA TTT TGA CTA CTG 337 GGG CCA GGG AAC CCT GGT CAC CGT CTC GAG CGG TGG AGG CGG TTC AGG 385 CGG AGG TGG CAG CGG CGG TGG CGG GTC GAC GGA CAT CCA GAT GAC CCA 433 GTC TCC ATC CTC CCT GTC TGC ATC TGT AGG AGA CAG AGT CAC CAT CAC 481 TTG CCG GGC AAG TCA GAG CAT TCG GGA TGT GTT AAG GTG GTA TCA GCA 529 GAA ACC AGG GAA AGC CCC TAA GCT CCT GAT CTA TGC TGC ATC CAG TTT 577 GCA AAG TGG GGT CCC ATC AAG GTT CAG TGG CAG TGG ATC TGG GAC AGA 625 TTT CAC TCT CAC CAT CAG CAG TCT GCA ACC TGA AGA TTT TGC AAC TTA CTA 673 CTG TCA ACA GAG TTA CAG TAC CCC TAC TAC GTT CGG CCA AGG GAC CAA 721 GGT GGA AAT CAA ACG GGC GGC CGC AGA ACA AAA ACT CAT CTC AGA AGA 769 GGA TCT GAA T
Abb.18: Nukleotidsequenz des Anti-Quinmerac-scFv B11und C11 und dessen schematische Darstellung. Gezeigt ist die Sequenz des komplementären Stranges als Triplettabfolge nach Sequenzierung im Vektor pITB11 und C11. Hervorgehoben ist der Linkerbereich sowie die für die Klonierung notwendigen Restriktionschnittstellen. Des weiteren sind die Oligonukleotide BACKLEGTOM und FORTOM1 eingezeichnet, die für die Einführung der für die Klonierung des scFv als BamHI-Fragment (in das Vektorfragment von pRTRA7/3) notwendigen BamHI-Restriktionsschnittstellen mit Hilfe der PCR-Methode verwendet werden. VH: Gen für die variable Domäne der schweren Kette; Linker: Linkersequenz; VL:
Gen für die variable Domäne der leichten Kette.
NotI 5’ SfiI
NcoI
3’
BACKLEGTOM
FORTOM1
SfiI/NcoI NotI VH Linker VL
BACKLEGTOM FORTOM1
5’ 3’
1 GGC CCA GCC GGC CAT GGC CGA GGT GCA GCT GTT GGA GTC TGG GGG AGG 49 CTT GGT ACA GCC TGG GGG GTC CCT GAG ACT CTC CTG TGC AGC CTC TGG 97 ATT CAC CTT TAG CAA TTA TCC TAT GCG TTG GGT CCG CCA GGC TCC AGG 145 GAA GGG GCT GGA GTG GGT CTC AGC TAT TAG TGG TAG TGG TGG TAG CAC 193 ATA CTA CGC AGA CTC CGT GAA GGG CCG GTT CAC CAT CTC CAG AGA CAA 241 TTC CAA GAA CAC GCT GTA TCT GCA AAT GAA CAG CCT GAG AGC CGA GGA 289 CAC GGC CGT ATA TTA CTG TGC GAA ACC TGG GCT TGC TTT TGA CTA CTG 337 GGG CCA GGG AAC CCT GGT CAC CGT CTC GAG CGG TGG AGG CGG TTC AGG 385 CGG AGG TGG CAG CGG CGG TGG CGG GTC GAC GGA CAT CCA GAT GAC CCA 433 GTC TCC ATC CTC CCT GTC TGC ATC TGT AGG AGA CAG AGT CAC CAT CAC 481 TTG CCG GGC AAG TCA GAG CAT TTC TAG GTC TTT ACG TTG GTA TCA GCA 529 GAA ACC AGG GAA AGC CCC TAA GCT CCT GAT CTA TGC TGC ATC CAG TTT 577 GCA AAG TGG GGT CCC ATC AAG GTT CAG TGG CAG TGG ATC TGG GAC AGA 625 TTT CAC TCT CAC CAT CAG CAG TCT GCA ACC TGA AGA TTT TGC AAC TTA CTA 673 CTG TCA ACA GAG TTA CAG TAC CCC TAC TAC GTT CGG CCA AGG GAC CAA 721 GGT GGA AAT CAA ACG GGC GGC CGC AGA ACA AAA ACT CAT CTC AGA AGA 769 GGA TCT GAA T
Abb.19: Nukleotidsequenz des Anti-Quinmerac-scFv H12 und dessen schematische
Darstellung. Gezeigt ist die Sequenz des komplementären Stranges als Triplettabfolge nach Sequenzierung im Vektor pITH12. Hervorgehoben ist der Linkerbereich sowie die für die Klonierung notwendigen Restriktionschnittstellen. Des weiteren sind die Oligonukleotide BACKLEGTOM und FORTOM1 eingezeichnet, die für die Einführung der für die Klonierung der scFv als Fragmente in das Vektorfragment von pRTRA7/3 nötigen BamHI-Restriktionsschnittstellen mit Hilfe der PCR-Methode verwendet werden. VH: Gen für die variable Domäne der schweren Kette; Linker: Linkersequenz; VL: Gen für die variable Domäne der leichten Kette.
SfiI/NcoI NotI VH Linker VL
NotI 5’ SfiI NcoI
3’
5’ 3’
BACKLEGTOM
FORTOM1
BACKLEGTOM FORTOM1
FR-H1 CDR-H1 FR-H2 CDR-H2
CDR-H2 FR-H3 CDR-H3 FR-H4
FR-L1 CDR-L1
FR-L2 CDR-L2 FR-L3 CDR-L3
CDR-L3 FR-L4 Linker
Mit Hilfe bestimmter Internetsequenzdatenbanken konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei den isolierten scFv-Gensequenzen um von menschlichen Antikörpern abgeleitete rekombinante Antikörperfragmente handelte. Zur Festlegung und Bestimmung der Positionen der hypervariablen Bereiche (CDR’s) und der umgebenden Antikörpergerüstregionen in den variablen Domänen der schweren und leichten Ketten wurde das von Kabat et al. (1991) entwickelte System verwendet.
B11 MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYPMRWVRQAPGKGLEWVSAISGS H12 MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYPMRWVRQAPGKGLEWVSAISGS
B11 GGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGPYFDYWGQGTL H12 GGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGLAFDYWGQGTL
B11 VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRDVLRW H12 VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRSLRW
B11 YQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYS H12 YQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYS
B11 TPTTFGQGTK VEIKRAA H12 TPTTFGQGTKVEIKRAA
Abb.20: Aminosäuresequenz der scFv-Gene B11 und H12. Dargestellt ist die von der analysierten DNA-Sequenz der Plasmide pITB11 und H12 abgeleitete Aminosäuresequenz.
Gekennzeichnet sind die hypervariablen Bereiche (CDR’s) der schweren und leichten Ketten Einkettenantikörper sowie die dazugehörigen Antikörpergerüstregionen (Framework-Regionen). Auftretende Sequenzunterschiede im direkten Vergleich der beiden scFv sind zusätzlich rot hinterlegt worden. VH: Sequenz für die variable Domäne der schweren Ketten;
CDR-H1-3 bzw. CDR-L1-3: hypervariable Bereiche der variablen schweren und leichten Ketten; VL: Sequenz für die variable Domäne der leichten Ketten; Linker: Linkersequenz;
FR-H1-3 bzw. FR-L1-3: Gerüstregionen der variablen schweren und leichten Ketten.
VH
VL
Zur weiteren Auswertung der Sequenzen wurden diese zusätzlich mit der Sequenz eines anderen bereits zuvor aus den Bibliotheken A und B isolierten und gegen ein Hormon gerichteten scFv-Antikörper verglichen. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Nukleotidsequenzen aller scFv’s (B11; H12 und Kontrolle) in den Antikörpergerüstregionen FR1-4 beider Ketten übereinstimmen, was auf die in den Bibliotheken verwendete menschliche Antikörpergerüstregion zurückzuführen ist. Signifikante Sequenzveränderungen traten vor allem im Bereich der hypervariablen Regionen (CDR’s), die im wesentlichen für die Antigenbindung verantwortlich sind, auf. Die Unterschiede betreffen den Austausch von Basen im Bereich der CDR’s H1, H3 und L1. Die festgestellten Unterschiede in den CDR‘s können auf die eingeführte Diversität („Side chain diversity“, „somatic mutation“) an definierten Positionen in diesen spezifisch antigenbindenden Bereichen der Klone der Bibliotheken zurückgeführt werden (siehe Protokoll des Herstellers). Nach Analyse der Sequenzen in einer speziellen Datenbank konnten die theoretischen Molekulargewichte und isolelektrischen Punkte der scFv-Proteine bestimmt werden (B11/C11, H12; Tabelle 2). Nach Auswertung aller Daten wurden die Klone B11 und H12 für die Herstellung der Expressionskassetten, die für die Vermittlung von Toleranz gegenüber dem applizierten Herbizid Quinmerac in Nicotiana tabacum verwendet werden sollen, ausgewählt.
Tab.2: Zusammenfassende Übersicht der mit Hilfe verschiedener Internetsequenzdatenbanken ermittelten theoretischen Molekulargewichte und isoelektrischen Punkte der funktionell charakterisierten scFv B11/C11 und H12.
Anti-Quin-scFv theoretisch bestimmtes
Molekulargewicht in kDa Theoretisch berechneter Isolelektrischer Punkt
B11/C11 27,6 8,3
H12 27,5 8,4
4.4 Chimäre Genkonstrukte zur Expression der Anti-Quin-scFv in Nicotiana