3. S YNTHETISCHE A MINOSÄURE - UND P EPTIDREZEPTOREN
3.4. Schlussfolgerung und Ausblick
Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Bereitstellung und Testung von Ammoniumrezeptoren zum Einsatz in der Aminosäure- und Peptiderkennung. In diesem Kapitel wurde der beste gefundene KEAS-Baustein in mehrere Rezeptorstrukturen eingebunden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindungsfähigkeit auch in einem größeren Molekül erhalten bleibt. Durch zusätzliche Seitengruppen bei der Bindung eines Ammonium-Ions bzw. kooperative Effekte bei Zusammenschluss zweier Erkennungseinheiten kann die Bindungsstärke gesteigert werden. Dabei kann auch auf Fluoreszenzänderungen als Indikator für die Bindung zurückgegriffen werden. Weiterhin bestätigen sich die zu Beginn der Arbeit getroffenen Annahmen, dass durch geeignete Verknüpfung von Bausteinen zum einen die Bindungsstärke aber auch die Selektivität zwischen verschiedenen ähnlichen Gastmolekülen steigt. Auch stellt sich heraus, dass mit zunehmender Flexibilität des Gastes – und damit auch im Umkehrschluss mit der des Rezeptors – die Präferenz zur Ausbildung eines definierten Komplexes abnimmt. Somit ist der Ansatz richtig, mit Einbau der Aminosäurefunktion in die C2- Achse der KEAS eine Einschränkung der Flexibilität zu erreichen.
Da die Untersuchungen und Charakterisierung des mit Michael Kruppa in Zusammenarbeit entwickelten Rezeptors 111 zum Abschluss dieser Arbeit noch nicht fertiggestellt ist, muss auf die Arbeit von Michael Kruppa verwiesen werden.
Der Einbau der KEAS 96 oder davon abgeleiteter Strukturen in verschiedene Rezeptoren wird in der Zukunft zeigen, wie sehr sich dieses Konzept auch zur Erkennung komplexer und großer Biomoleküle eignet. Erste Schritte in diese Richtung werden die Darstellung eines Trimers von 96 und dessen Anwendung auf Peptide mit 3 Ammoniumgruppen sein. Auch Experimente mit verschiedenen Spacerlängen zwischen den einzelnen Kronenethereinheiten werden wichtige Erkenntnisse zu den Einflüssen von Flexibilität und Vororientierung liefern.
C Zusammenfassung
Die Erkennung von Peptiden und Enzymen spielt in der Natur eine herausragende Rolle, wie z.B. bei Signalübertragungsprozessen. Die dabei erreichten Selektivitäten und Bindungsstärken sind auf eine hohe Anzahl sich gegenseitig unterstützender Bindungsereignisse zurückzuführen. Um dieses Konzept multipler Bindungsstellen für ein Biomolekül in einem Rezeptor realisieren zu können, ist es nötig, verknüpfbare Bausteine für verschiedene zu erkennende funktionelle Gruppen zu entwickeln.
Diese Arbeit leistet hierzu einen Beitrag durch die Entwicklung von Ammonium-Ion bindenen Kronenetherbausteinen. Im ersten Kapitel werden Kronenether verschiedener Struktur synthetisiert und getestet. Allen gemeinsam ist dabei der Aminosäurecharakter und eine fluoreszierende Phthalimideinheit, die als Fluoreszenzsensor zur Anzeige von Bindungsprozessen dient. Als Referenz werden zusätzlich noch einfache Kronenether mit Carbonsäure- aber ohne Aminoende dargestellt, da anhand dieser Verbindungen die maximal möglichen Bindungskonstanten abgeschätzt werden können.
Durch Vergleich der Bindungseigenschaften für Kalium- und n-Butylammonium-Ionen werden Kronenether (96, 97) mit einer Azabenzo-21-Krone-7 Geometrie als am geeignetsten identifiziert. Diese zeichnen sich durch vergleichbare Bindungsstärken für Ammonium-Ionen (K = 1.8 * 102 M-1 in Methanol) mit einem strukturell ähnlichen Benzo-18-Krone-6 Molekül aus. Der große Vorteil der entwickelten Kronenether-Aminosäuren ist die im Vergleich zur Referenzsubstanz beobachtete Fluoreszenzsteigerung um bis zu Faktor 4. Damit sind Bausteine für den Einsatz in größeren Rezeptoren gefunden.
Die Verwendung der im ersten Teil gefundenen Bausteine wird im zweiten Kapitel beschrieben. Zunächst wird durch einfache Umsetzung am Aminoende der Kronenetheraminosäure 96 mit n-Butylisocyanat ein Lariatether mit Harnstofffunktionalität dargestellt. Bedingt durch das als Wasserstoffbrücken-Akzeptor fungierende Sauerstoffatom des Harnstoffes kann eine Steigerung der Ammonium-Ion Bindung um ca. 50 % erreicht werden. Die Titration des Lariatethers mit ungeschützten zwitterionischen Aminosäuren soll eine Bindungsverstärkung durch Wasserstoffbrücken zwischen den H-Atomen des Harnstoffes und dem Carboxylat der Aminosäure zeigen, kann aufgrund der geringen Löslichkeit der Aminosäuren aber nur in gepufferter Lösung durchgeführt werden. Die
ermittelte Bindungskonstante ist ca. 1 M-1 und damit zu klein, um von analytischem Nutzen zu sein.
Ein weiterer Rezeptor entsteht durch Kombination des Kronenethers mit einem Histidin bindenden Cu-IDA-Motiv. Dies geschieht in Zusammenarbeit mit Michael Kruppa. Die Synthese des Zielmoleküls ist zum Zeitpunkt des Abschlusses dieser Arbeit noch nicht beendet. Daher wird zum weiteren Fortgang auf die Arbeit von Michael Kruppa verwiesen.
Die Verknüpfung des Kronenetherbausteines 96 zum Dipeptid liefert einen dritten Rezeptor.
Dieser bindet Lysinmethylester Dihydrochlorid in Methanol mit einer Bindungsstärke von mindestens 2 * 104 M-1. Die beiden Kronenether des Rezeptors sind dabei aufgrund verschiedener Emissionswellenlängen einzeln beobachtbar. Damit lassen sich auch die Bindungskonstanten für beide einzeln bestimmen. Die Titrationsdaten weisen auf eine 1:1 Stöchiometrie des Komplexes hin, was durch eine Auftragung nach Job bestätigt werden kann. Das Zusammenwirken von zwei kovalent verknüpften Kronenethern bewirkt eine Verhundertfachung der Bindungskonstante für Ammonium-Ionen von ca. 200 M-1 auf ca.
20000 M-1. Die geeignete Kombination von Einzelbausteinen zu einem größeren Rezeptor ermöglicht somit eine deutliche Erhöhung der Bindungsstärke.
Die Selektivität der Bindung von Tripeptiden wird anhand von drei Verbindungen untersucht.
Hierbei handelt es sich um die drei möglichen Kombinationen von zwei Glycinen mit einem Lysin (Peptide jeweils als Methylester-dihydrochlorid). Die Auswertung der Titrationsergebnisse zeigt eine deutliche Präferenz der Bindung für N-terminales Lysin mit einer sukzessiven Abnahme der Bindungsstärke bei zunehmendem Abstand zwischen den Ammonium-Gruppen. Damit ist gezeigt, dass die räumliche Vororientierung von Rezeptorbausteinen durch kovalente Verknüpfung ihre Bindungsstärke und die Selektivität der Komplexierung erhöht.