4 Diskussion
4.3 Schlussfolgerung und Ausblick
Anhand der Untersuchungen des gesamten PBMC-Kompartiments von therapienaїven AIH-Patienten bezüglich der Expression von TH1-, TH17- und TH2-assoziierten Zytokinen auf RNA-Ebene konnte keine dominierende Effektorzellpopulation in der Peripherie identifiziert werden. Jedoch zeichneten sich die Zellen in ihrer Gesamtheit vor allem durch eine signifikant erhöhte TNF-Expression aus, aber auch IL10 war erhöht. Dahingegen waren TGFB und IL4 im gleichen Maße und IFNG, IL2, IL17A, IL22, IL6
und IL13 verglichen zur Kontrollgruppe niedriger exprimiert. Außerdem geben die Daten erste Hinweise darauf, dass vor allem Zellen mit TH17- und TH2-Profil keine tragende Rolle in der Peripherie von AIH-Patienten zu haben scheinen. Des Weiteren verweisen die Daten auf eine mögliche Implikation von Tr1-Zellen, welche sich durch Sekretion von großen Mengen IL-10, moderaten Mengen an TGF, wenig IL-5 und IFN, sowie kein IL-2 oder IL-4 auszeichnen238,239. Inwieweit und ob diese regulatorische Zellpopulation tatsächlich in die AIH-Pathogenese involviert ist, bedarf weiterer Untersuchungen. Da es sich bei PBMC um ein Gemisch verschiedener Zellen handelt, wurde weiterführend die Expression von TH1- und TH17-assoziierten Zytokinen, im speziellen auf CD4+ und CD8+ T-Zellen, untersucht. Prinzipiell konnte in therapienaїven AIH-Patienten eine numerische Verschiebung zugunsten der CD4+ T-Zellen festgestellt werden. Des Weiteren konnte sowohl bei den CD4+ als auch CD8+ T-Zellen eine hohe Frequenz von TNFα-sezernierenden Zellen gemessen werden, im Falle der CD8+ T-Zellen sogar signifikant mehr als in der Kontrolle. Dagegen war die Frequenz von IL-17A+ bzw. IFN+IL-17A+ CD4+ und CD8+ T-Zellen gering bis nicht nachweisbar, was eine Implikation von TH17-Zellen in der Peripherie von AIH-Patienten ausschließt.
Die Genexpressionsstudien der LIL zeigten bezüglich der TH1-assoziierten Gene eine signifikant höhere Expression im Vergleich zur Kontrolle, wohingegen die Gene der TH17-assoziierten Zytokine keine erhöhte Expression aufwiesen. Auch auf Proteinebene zeichneten sich leberinfiltrierende CD4+ und CD8+ T-Zellen durch eine erhöhte IFN- und TNFα-Sekretion im Vergleich zur Peripherie von AIH-Patienten aus, wohingegen die Frequenz von IL-17A-sezernierenden Zellen gering war. Seit der Beschreibung von TH17-Zellen im Jahre 2005 als eigenständige pathogene Zellpopulation im Kontext von Autoimmunität319-321 wurde eine Implikation in verschiedenen humanen Erkrankungen autoimmuner Genese festgestellt, z.B. bei der MS, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, RA und Psoriasis322-325 sowie der autoimmunen Lebererkrankung PBC326. Auch für die AIH-Pathogenese werden TH17-Zellen als Effektorpopulation diskutiert111,163,181,233
. Dies widerlegen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, sondern verweisen vielmehr auf einen TH1- bzw. TC1-Status der LIL in den AIH-Patienten. Weiterhin könnte auch anhand der leicht erhöhten intrahepatischen Expression TH 2-assoziierter Gene auf eine Beteiligung von TH2-Zellen an der AIH-Immunpathogenese geschlossen werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte vor allem eine stark erhöhte Expression und Sekretion von TNFα durch Zellen sowohl in der Peripherie als auch in der Leber von AIH-Patienten bestimmt werden.
Einzig im Zellkulturüberstand unspezifisch stimulierter PBMC von AIH-Patienten konnte im Vergleich zu gesunden Probanden weniger TNFα nachgewiesen werden, was auf die Expression von mTNFα auf aktivierten PBMC hindeuten könnte. Inwieweit und ob mTNFα auf aktivierten T-Zellen von AIH-Patienten exprimiert wird, bedarf weiterführender durchflusszytometrischer Untersuchungen.
Dennoch legen die TNFα-Daten der vorliegenden Arbeit eine eminente Rolle dieses Effektorzytokins
in der AIH-Immunpathogenese nahe. Unterstützt wird dies durch eine erfolgreich durchgeführte Off-Label-Therapie mit anti-TNFα bei einem schwer zu behandelndem AIH-Fall272.
Sowohl die PBMC als auch die LIL der AIH-Patienten wiesen eine erhöhte Expression der Chemokinliganden CXCL9, CXCL10 und CXCL11 auf. Diese Liganden sind nicht konstitutiv exprimiert, werden aber in Gegenwart eines proinflammatorischen Zytokinmilieus aufreguliert und rekrutieren T-Zellen zum Ort der Entzündung282. Insbesondere CXCL10 zeigte die höchste Expression in den LIL der AIH-Patienten. Dieser Ligand wird auch durch CD4+ und CD8+ T-Zellen sezerniert und funktionell als TH1-Chemokin kategorisiert182,285. Als klassische Chemokinrezeptorkombination gelten für TH1- bzw. TC1-Zellen CXCR3/CCR524,188-190,280
und für TH17- bzw. TC17-Zellen CXCR3/CCR624,181. Bei den Genexpressionsstudien der vorliegenden Arbeit wiesen sowohl CCR5 als auch CCR6 in den PBMC und LIL eine geringere Expression im Vergleich zur Kontrolle auf. Jedoch zeigte sich beim direkten Vergleich der Expressionsniveaus, dass CCR5 stärker exprimiert war als CCR6. Dies würde zwar die bisherigen Ergebnisse der TH1-Dominanz der LIL in der Leber von AIH-Patienten unterstützen, allerdings zeigte auch der CCR5-Ligand CCL5 eine verminderte Expression im Vergleich zur Kontrolle.
Jedoch sind Redundanz und Promiskuität Charakteristika des Chemokinsystems174. So sind neben CCL5 auch CCL3 und CCL4 Liganden von CCR5, aber auch dem alternativen Rezeptor CCR124,206,289,290
. Daher bedarf es einer Erweiterung der Analysen bezüglich des Profils von Chemokinrezeptoren und -liganden sowie einer Überprüfung der Expression auch auf Proteinebene. In der Summe zeigen die hier vorgestellten Untersuchungen, dass im PBMC- und LIL-Kompartiment die CXCR3-Liganden CXCL9, CXCL10 und CXCL11 aufgrund ihrer starken Aufregulation eine wichtige Rolle in der Rekrutierung innezuhaben scheinen. Weiterführend sollte untersucht werden, welche Zellpopulationen in der Leber für die erhöhte Expression verantwortlich sind. Auch T-Zellen können diese Liganden exprimieren und so in der Leber zur Pathogenese der AIH beitragen, indem sie zusätzlich zur Sekretion proinflammatorischer Zytokine auch durch Sekretion inflammatorischer Chemokine die T-Zellinfiltration weiter verstärken. Hieraus könnte einer positiver Feedback-Loop entstehen, der die Entzündung weiter fördert.
GM-CSF gilt in neueren Studien als Kandidat für therapeutische Ansätze bei Autoimmun- und Entzündungserkrankungen297,298. In der vorliegenden Arbeit konnte eine erhöhte Expression von M-CSF und GM-CSF in den LIL von AIH-Patienten nachgewiesen werden. Beiden CSF wird eine pathologische Rolle in verschiedenen Autoimmunerkrankungen zugewiesen210,291-294
. Durch Noster et al. wurde in der MS eine Verbindung der GM-CSF-Produktion mit TH1-Zellen beschrieben211, was die bisher vorgestellten Daten bezüglich des TH1-Phänotyps der LIL in AIH-Patienten unterstützt.
Jedoch wurde die Expression bisher nur auf RNA-Ebene in den Gesamt-LIL nachgewiesen und bedarf einer Verifikation auf Proteinebene. Des Weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Genexpression der zytolytischen Proteine Granulysin, Granzym B und Perforin in den LIL der
AIH-Patienten signifikant erhöht war, was auf den zytotoxischen Status der intrahepatischen Lymphozyten verweist. Auch hier bedarf es der Untersuchung auf Proteinebene, im speziellen ob diese Proteine durch CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen synthetisiert werden. Generell gelten CD8+ T-Zellen als die zytotoxische Effektorpopulation, mittlerweile sind aber auch CD4+ T-Zellen mit zytotoxischem Charakter beschrieben, die häufig aufgrund der Produktion von IFN, TNFα und IL-2 als TH1-ähnlich gelten62,301-306.
Da die AIH, mit einer Prävalenz von 10,7 - 23,9/100.000 Einwohnern in Europa113-115, eine seltene Erkrankung darstellt, ist die Verfügbarkeit von geeignetem Probenmaterial begrenzt. Insbesondere die Probenverfügbarkeit von therapienaїven Patienten ist gering, im Speziellen von Lebergewebe zur Isolierung der LIL. Deshalb beruhen die Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit auf teilweise kleinen Gruppengrößen. Ein Aspekt für weitere Untersuchungen stellt somit die Erweiterung der Kohorten dar, ein Anderer die Akquisition weiterer adäquater Kontrollen für die Untersuchung des intrahepatischen Milieus.
4.3.2 Das T-Zellrezeptorrepertoire von AIH-Patienten
Zur Untersuchung des TCR-Repertoires wurden LIL aus dem Lebergewebe von AIH-Patienten isoliert und expandiert. Die Analysen der T-Zellklone hinsichtlich der Expression spezifischer TCR V-Ketten zeigten, dass Vb 8 am häufigsten vertreten war, gefolgt von Vb 2 und Vb 17. Sowohl die Daten der vorliegenden Arbeit, aber auch die Ergebnisse weiterer Studien315-318 suggerieren grundsätzlich ein eingeschränktes TCR V-Repertoire von Patienten, was auf eine antigengetriebene AIH-Pathogenese hinweist. Dennoch bedarf es weiterführender Analysen hinsichtlich der Verteilung des TCR-Repertoires und der Identifizierung weiterer potentieller Autoantigene. Hierfür werden zurzeit die in dieser Arbeit klonal expandierten T-Zellkulturen mithilfe des TCR CDR3-Spectratypings untersucht und deren Zielantigene mithilfe von sog. Kombinatorischen Peptidbibliotheken im positional scanning-Format identifiziert. Dabei handelt es sich um mehrere komplexe Peptidgemische, die jeweils eine definierte Aminosäure an einer definierten Position aufweisen und mit denen im Screening-Verfahren die aktivste Aminosäure an jeder Position bestimmt werden kann327,328. Die Daten dieser Experimente sollen im Folgenden in systematischen Datenbankanalysen verwendet werden, um das gesamte Spektrum der Zielantigene identifizieren zu können. Die prognostizierten Peptide von hepatotropen, aber auch xenogenen Produkten sowie von leberspezifischen und ubiquitären Autoantigenen sollen synthetisiert werden und deren stimulatorische Kapazität evaluiert werden. Hierdurch ist es zudem möglich, das Spektrum von potentiellen Autoantigenen zu beurteilen. Außerdem könnten diese Analysen wichtige Hinweise auf mögliche Umweltfaktoren geben, die an der Induktion der AIH beteiligt sein könnten. So wird molekulares Mimikry als Ursache für Autoimmunerkrankungen diskutiert: In diesem Modell wird die
gegen Fremdantigene gerichtete Immunantwort durch eine strukturelle Ähnlichkeit von Fremdantigenen und Autoantigenen hervorgerufen100,111,148
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