3.2 Tiere
5.2.5 Schlussbetrachtung der In-vitro-Studie
In dieser Studie wurden die Grundlagen für die Gewinnung adulter caniner SZ gelegt, um sie für eine mögliche Transplantation ins periphere Nervensystem zu gewinnen. Die neuen etab-lierten Techniken basieren auf Erfahrungen mit kultivierten und transfizierten Ratten- und humanen SZ am Institut für Neuroanatomie, MHH. In der vorliegenden Arbeit wurden die Techniken der verschiedenen Protokolle kombiniert und nach eigenen Erfahrungen modifi-ziert, um sie schließlich für neue Kultursysteme caniner SZ zu etablieren.
Die zum ersten Mal angewandten Verfahren zur Aufreinigung der Kulturen führten auf schnelle und einfache Weise zu einer signifikanten Steigerung des Anteils an caninen SZ mit einer Reinheit von 80% caniner SZ, was das 2,5fache vorheriger Studien ist (Pauls et al.
Diskussion
2004). Besonders durch die Aufreinigung mittels Dynabeads konnte die Anzahl der Fibroblasten gemindert bzw. der SZ-Anteil gesteigert werden. Durch dieses Verfahren konn-ten diese Werte bereits nach 3-4 Wochen erreicht werde, was nur die Hälfte der Zeit bisher vorliegenden Studien entspricht. Das Zeitfenster, um naive oder genetisch modifizierte canine SZ für eine Transplantation in eine Nervenlücke zu gewinnen, ist entscheidend für die weitere Prognose, die umso günstiger ist, je kürzer die Zeit nach der Verletzung ist.
Doch die niedrige Proliferationsrate und damit die relativ geringe Anzahl an SZ erbrachten nicht die erhofften Resultate, so dass diesbezüglich weitere Studien folgen müssen. Durch die Wahl eines weiteren, spezifischen Mitogens könnte die Zahl der SZ gesteigert werden, wie es auch bei humanen SZ möglich ist.
Ein weiterer negativer Einfluss auf die niedrige Anzahl an SZ wird das relativ hohe Alter der Hunde sein (durchschnittlich 10,57 ± 2,15 Jahre). Denn mit zunehmendem Alter lässt die Tei-lungsfähigkeit der SZ nach.
Durch die Elektroporation konnte eine Möglichkeit der schnellen und sicheren Methode zur genetischen Modifikation getestet werden, die weiter modifiziert werden sollte, wie durch die erhöhte Zugabe an Plasmid-DNA.
Insgesamt kann durch diesen Teil der Studie ein neuer Ansatz für die Rekonstruktion nach pe-ripheren Nervenläsionen für kleine Haustiere in Zukunft möglich sein.
Zusammenfassung
VI Zusammenfassung
Peer Seef: Genetische Modifikation von Schwann-Zellen der Ratte und des Hundes - in-vitro-Charakterisierung und funktionelle und histologische Untersuchung nach Transplantation im Regenerationsmodell des Nervus ischiadicus der adul-ten Ratte
Für die Entwicklung alternativer Therapien im Rahmen der peripheren Nervenrekonstruktion spielen Schwann-Zellen (SZ) eine wichtige Rolle. SZ bilden am Ort der Verletzung ein rege-nerationsfördendes Milieu. Neben anderen Proteinen werden neurotrophe Substanzen nach Verletzungen des peripheren Nerven vermehrt exprimiert.
Neben Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2) sind auch Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und Neurotrophin-3 (NT-3) in diesem Zusammenhang von Interesse. Deshalb wur-den für die vorliegende Arbeit SZ genetisch so modifiziert, dass sie BDNF und NT-3 übe-rexprimierten. Diese SZ wurden in ein Silikonröhrchen gefüllt und zur Überbrückung einer Distanz von 13 mm zwischen den proximalen und den distalen Stumpf durchtrennter Nn.
ischiadici adulter Ratten eingenäht. Innerhalb eines Beobachtungszeitraums von 3 Monaten wurden motorische und sensorische Untersuchungen bezüglich der funktionellen Nervenrege-neration durchgeführt. Im Anschluss daran wurden die Regenerate morphometrisch unter-sucht, um die Quantität und die Qualität der regenerierten myelinisierten Axone zu prüfen und eventuelle Unterschiede zwischen beiden Gruppen festzustellen.
Ex vivo Gentherapie mit BDNF oder NT-3 zeigte positive Effekte auf die axonale Regenera-tion, dennoch ergab sich kein signifikanter Unterschied zum Einsatz naiver SZ. Darüber hin-aus konnte im gewählten Beobachtungszeitraum keine funktionelle Regeneration festgestellt werden.
In der Zukunft müssen weitere Studien die gewonnenen Ergebnisse ergänzen, um den Einsatz von BDNF- oder NT-3-Gentherapie in der Therapie peripherer Nervenläsionen gesichert be-werten zu können.
Auch in der Veterinärmedizin kommt es häufig zu Läsionen peripherer Nerven durch Ver-kehrsunfälle, Biss- oder Schussverletzungen. Die chirurgische Versorgung solcher
Verletzun-Zusammenfassung
gen ist aber häufig unbefriedigend. Auch hier kann ein Therapieansatz sein, SZ in einem Füh-rungskanal in die entstandene Nervenlücke zu implantieren.
Als Voraussetzung für den Einsatz von SZ-Transplantaten bei Hunden wurden in der vorlie-genden Arbeit Techniken für die Isolation, Anreicherung und genetische Modifikation caniner SZ etabliert. Dieses geschah durch Modifikation eines publizierten Protokolls Dritter für die Kultivierung caniner SZ und von Protokollen, die am Institut für Neuroanatomie für die Kul-tivierung, Aufreinigung und Transfektion adulter SZ der Ratte und des Menschen zuvor etab-liert worden waren.
Zum Erhalt einer hohen Zellausbeute mussten die epineurium-freien peripheren Nerven (Nn.
ischiadici adulter Hunde) zunächst in vitro prädegeneriert werden. Nach der Primäraussaat konnten kontaminierende Fibroblasten durch selektive Kulturbedingungen in ihrem Wachs-tum gehemmt werden. Außerdem wurden zur Eliminierung von Fibroblasten und Anreiche-rung der caninen SZ erstmalig Dynabeads verwendet. Der Anteil an caninen SZ von 30% in der 1. Passage konnte auf 80% in der 3. Passage erhöht werden. Die Reinheit der Kulturen wurde mit immunzytochemischen Methoden und Fluoreszenzmikroskopie evaluiert. Eine ho-he Reinho-heit und Zellausbeute konnte mit den gewählten Methoden nach einer 3-4wöchigen Kultivierungsphase erreicht werden. Diese, erstmals beschriebene, kurze Zeitspanne wird ei-nen späteren klinischen Einsatz der Transplantation adulter caniner SZ erleichtern. Schließlich wurde die Elektroporation als Verfahren zur genetischen Veränderung von caninen SZ getes-tet. Dabei wurde eine Transfektionsrate von 20% erzielt.
Mit dem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit konnte die Grundvoraussetzung für weitere Untersuchungen geschaffen werden, die den Einsatz von caninen SZ im Sinne des Tissue En-gineering bei der peripheren Nervenrekonstruktion in der Veterinärmedizin entwickeln helfen.
Summary
VII Summary
Peer Seef: Genetic modification of Schwann cells of the rat and the dog
- in-vitro-characterization of the Schwann cells and functional and histological examination after transplantation in a rat model of peripheral nerve regenerati-on across lregenerati-ong gaps
In the development of alternative therapies for peripheral nerve reconstruction, Schwann cells (SC) play a crucial role. SC produce a regeneration promoting milieu at the site of injury.
Among other proteins, expression of neurotrophic factors is increased after peripheral nerve injury.
Besides Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) also Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) as well as Neurotrophin-3 (NT-3) are interesting proteins in the given context. In the current study, SC were therefore genetically modified to over-express BDNF or NT-3. These modi-fied SC were injected into silicone tubes. These tube were implanted into transected sciatic nerves of adult rats to bridge a 13 mm gap between the proximal a d distal nerve stumps. Over three months post surgery functional regeneration was evaluated with motor and sensory tests.
After sacrifice of the animals, regenerated nerve tissue from both groups was morphometri-cally analyzed with regard to quantity and quality of regenerated myelinated axons.
Ex vivo gene therapy with BDNF or NT-3 showed a positive effect on axonal regeneration, however this was not significant in comparison to transplantation of naïve SC. Furthermore, no functional regeneration was detectable during the chosen observation period.
Future studies are needed to substitute the results of the current study and to provide clear rat-ing of the potential of BDNF or NT-3 gene therapy in peripheral nerve reconstruction ap-proaches.
Also in veterinary medicine, peripheral nerve injuries are commonly seen, e.g. after traffic ac-cidents or biting or shooting events. Surgical therapies are cumbersome. An alternative thera-peutical approach is again implantation of SC filled nerve guidance channels.
As a prerequisite for the use of SC transplants in dogs, protocols were established to culture canine SC in sufficient amounts and purity as well as first transfection approaches have been
Summary
performed in the current study. The established methods were based on one reported protocol for canine SC cultures from others and protocols established at the institute for neuroanatomy for culture, purification and transfection of adult rat and human SC.
To obtain high cell numbers, epineurium-free peripheral nerves (sciatic nerves of adult dogs) had to be in vitro predegenerated. After primary seeding of the cells, growth of contaminating fibroblasts was impaired by SC selective culture conditions. Additionally Dynabeads were used for the first time to eliminate fibroblasts and to enrich canine SC. Percentage of canine SC was increased from 30% in 1. passage cultures to 80% in 3. passage cultures. Purity of cultures was determined by immunocytochemistry and fluorescence microscopy. High purity and SC numbers were obtained after only 3-4 weeks in vitro. This short time frame, reported for the first time, will facilitate future clinical use of adult canine SC within transplantation approaches. Finally, electroporation was tested to genetically modify canine SC. A transfec-tion rate of 20% was achieved.
The second part of the current study contributes as a basis to the establishment of SC based tissue engineering approaches for peripheral nerve reconstruction in veterinary medicine.
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