Rolle von Zytokinen bei der Hsp60-vermittelten T-Zellstimulation

Obwohl Hsp60 im Endotoxin-freien Testsystem in APZ weder die Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle noch die Freisetzung der untersuchten Zytokine induzieren konnte, wurde in Gegenwart von membrangebundenem Hsp60 oder löslichem Hsp60-Ig eine verstärkte Freisetzung des Zytokins IFNγ bei der antigenabhängigen Aktivierung naiver T-Zellen beobachtet. Hierbei könnten auch geringe Zytokinmengen, die mit den zur Verfügung stehenden Mitteln möglicherweise nicht mehr nachweisbar waren, eine Rolle spielen. Bei der T-Zellaktivierung stehen APZ und T-Zelle in engem Kontakt (Kupfer und Kupfer, 2003), so dass über die kurze Distanz innerhalb der immunologischen Synapse auch geringe Zytokinkonzentrationen eine biologische Wirkung entfalten können. Zudem sind komplexe Rückkopplungsmechanismen bekannt, die sowohl autokrin wie auch parakrin wirksam sein können. Beispielsweise wirkt das von den T-Zellen produzierte IFNγ seinerseits aktivierend auf APZ wie DC und Makrophagen ein und verstärkt unter anderem die Expression von IL-12 (Ma et al., 1996).

Um den Beitrag der Zytokine IL-6, IL-12 und TNFα bei der Hsp60-vermittelten Steigerung der IFNγ-Produktion in T-Zellen zu untersuchen, wurden im in vitro-Testsystem zur Stimulation naiver CD4⁺-T-Zellen neutralisierende Antikörper eingesetzt, die die biologische Aktivität der genannten Zytokine inhibieren. Die Ergebnisse dieser Experimente haben erstmals gezeigt, dass weder IL-6 und TNFα noch IL-12 bei der Hsp60-vermittelten Steigerung der IFNγ-Produktion bei der Aktivierung naiver CD4⁺- T-Zellen eine Rolle spielen. Im Gegensatz hierzu konnte sowohl die

Neutralisation von TNFα- als auch IL-12, nicht aber die Inhibition von IL-6, die LPS-induzierte IFNγ-Sekretion drastisch reduzieren. Im Gegensatz zu Hsp60 ist deshalb die Stimulation der IFNγ-Produktion in T-Zellen durch LPS abhängig von TNFα und IL-12. Zudem belegt diese Kontrolle die neutralisierende biologische Aktivität der verwendeten Antikörper in der hier eingesetzten Konzentration im Testsystem.

Dass Hsp60 die IFNγ-Produktion in T-Zellen tatsächlich unabhängig von IL-12 und auch IL-23 stimulieren kann, wurde schließlich eindeutig bei der Stimulation von APZ und T-Zellen aus IL-12p40^-/--Mäusen demonstriert. Die Zellen dieser Tiere exprimieren durch die Deletion der gemeinsamen p40-Untereinheit von IL-12 und IL-23 weder funktionelles IL-12 noch IL-23 (Magram et al., 1996). Dennoch wurde in Gegenwart von mHsp60-exprimierenden X63-Zellen die durch das TCR-Engagement über anti-CD3 induzierte IFNγ-Expression signifikant gesteigert. LPS hatte hingegen in diesem System erwartungsgemäß keinen Einfluss auf die IFNγ-Produktion.

Die Steigerung der IFNγ-Freisetzung durch T-Zellen bei Stimulation mit LPS ist somit strikt von IL-12 und auch TNFα, deren Expression in APZ durch LPS induziert wird, abhängig. Hsp60 dagegen stimuliert die IFNγ-Produktion in T-Zellen unabhängig von IL-6, IL-12, IL-23 und TNFα. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu den von Breloer et al. (2001 und 2002) publizierten Resultaten, die die Abhängigkeit der Hsp60-induzierten IFNγ-Produktion in T-Zellen von dem von APZ produzierten Zytokin IL-12 zeigen, und deutet darauf hin, dass die beobachteten Effekte wahrscheinlich auf eine Kontamination des verwendeten Hsp60-Proteins mit bakteriellen Endotoxinen wie LPS zurückzuführen ist.

Weitere Zytokine, die einen wichtigen Beitrag zur Induktion und Polarisierung einer TH1- und CTL-Immunantwort leisten, sind die Typ I-Interferone IFNα und IFNβ. Ihre Expression wird in monozytären Zellen über TLR induziert, die neben dem zentralen MyD88-Signalweg, der zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB führt, zusätzlich einen alternativen Signalweg nutzen, der in der Aktivierung des IFN-regulierenden Transkriptionsfaktors IRF3 und der Expression der Typ I-Interferone resultiert (Akira und Hoshino, 2003; Übersicht bei Imler und Hoffmann, 2003;

Übersicht bei Barton und Medzhitov, 2003). Zu diesen TLR gehört neben TLR3, 7 und 9 auch der putative signalgebende Hsp60-Rezeptor TLR4 (Übersicht bei Imler und Hoffmann, 2003; Übersicht bei Barton und Medzhitov, 2003; Übersicht bei Malmgaard, 2004). IFNα und IFNβ sind insbesondere bei der Initiation antiviraler Immunantworten

(Übersicht bei Malmgaard, 2004; Übersicht bei Theofilopoulos, 2004), aber auch bei der Bekämpfung und Immunotherapie von Tumoren von Bedeutung (Gutterman, 1994;

Übersicht bei Grander und Einhorn, 1998; Übersicht bei Smyth et al., 2004). Sie aktivieren wie IL-12 in DC und T-Zellen ebenfalls die Produktion von IFNγ und tragen so zur Induktion und Aufrechterhaltung einer TH1- und CTL-Immunantwort bei (Brinkmann et al., 1993; Cousens et al., 1999; Montoya et al., 2002; Übersicht bei Smyth et al., 2004). Zudem inhibieren sie zwar die Produktion von IL-12, stimulieren jedoch die Expression der hochaffinen IL-12-Rezeptoruntereinheit IL-12Rβ2 in CD4⁺ -T-Zellen (Biron, 2001). Auf diese Weise steigern die Typ I-Interferone die Responsivität der CD4⁺-T-Zellen gegenüber dem IFNγ-induzierenden Zytokin IL-12 und leisten so einen weiteren Beitrag zur Ausbildung einer TH1-Antwort.

Auch die Beteiligung der Typ I-Interferone IFNα und IFNβ an der adjuvanten Wirkung von Hsp60 bei der T-Zellaktivierung wurde durch den Einsatz neutralisierender Antikörper untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die Steigerung der IFNγ-Antwort in Gegenwart mHsp60-exprimierender X63-Zellen bei Neutralisation von IFNα schwächer ausgeprägt war als in den Kontrollkulturen ohne oder mit anti-IL-12-Kontrollantikörper oder bei Blockade von IFNβ. Dieses Ergebnis deutet auf eine mögliche Funktion von IFNα bei der durch Hsp60 vermittelten Steigerung der IFNγ -Expression in T-Zellen hin. Auf die Stimulation der IFNγ-Produktion durch LPS hatte die Inhibition dieser Zytokine hingegen keinen Einfluss. Da LPS aber die Sekretion großer Mengen IL-12 und anderer Zytokine in Makrophagen induziert, können diese vermutlich das Fehlen der Typ I-Interferone bei der Induktion von IFNγ in T-Zellen kompensieren.

Da weder ein IFNα- noch IFNβ-spezifischer ELISA zur Verfügung stand, konnte weder die Expression dieser Zytokine in APZ noch die neutralisierende Wirkung der anti-IFNα- und anti-IFNβ-Antikörper wie bei der Inhibition von IL-6, IL-12 und TNFα durch die entsprechenden Antikörper überprüft werden. Unklar bleibt deshalb, ob die zur Neutralisation der Typ I-Interferone eingesetzten Antikörper die Aktivität dieser Zytokine vollständig inhibieren konnten. Insbesondere die Neutralisation von IFNα ist möglicherweise schwierig. Während IFNβ ein singuläres Mitglied der Typ I-Interferonfamilie ist, zu der neben IFNα und IFNβ in der Maus die Interferone ε, κ, ω und τ gehören, sind in der Maus wie beim Menschen zwanzig IFNα-Gene bekannt.

Dreizehn von diesen kodieren funktionelle IFNα-Subtypen (Schlaak et al., 2002;

Theofilopoulos et al., 2005). Bei dem hier eingesetzten neutralisierenden Antikörper gegen IFNα handelt es sich jedoch um einen monoklonalen Antikörper, der wahrscheinlich nicht alle IFNα-Subtypen inhibieren kann. Dennoch konnte dieser Antikörper die Hsp60-stimulierte IFNγ-Produktion bereits deutlich reduzieren. Ein wichtiges Ziel ist deshalb, die Funktion dieses Zytokins bei der Hsp60-vermittelten Zytokinproduktion in T-Zellen durch den Einsatz neutralisierender polyklonaler Antikörper zu überprüfen.

4.4.3 Kostimulation mit LPS-kontaminiertem und LPS-freiem Hsp60 –