5. Diskussion
5.2 Die Rolle von CD163 bei den Protoporphyrin-vermittelten Effekten auf den
Die verwendeten Protoporphyrine CoPP und Hämin weisen sehr große strukturelle Ähnlichkeiten zu dem physiologisch vorkommenden Hämprotein auf, welches zusammen mit drei weiteren Hämproteinen ein Hämoglobinmolekül bildet. Freies Hämoglobin wird mit Hilfe von Scavengerproteinen (Hemopexin, Haptoglobin) rezeptorabhängig in die Zelle aufgenommen und dort mittels Hämoxygenase abgebaut. Die strukturelle Ähnlichkeit der Protoporphyrine führt zu der Überlegung, dass die drei Moleküle über denselben Mechanismus in die Zelle gelangen und daher die gleichen Effekte auf die Zellen haben. So zeigte sich, dass eine Behandlung von humanen Monozyten sowohl mit freiem Hämoglobin (Hb) (Abb. 29) als auch mit Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexen (Abb. 27B) zu einem ähnlichen Phänotyp (Hemmung der MHC-II Expression) führt, wie nach einer Behandlung mit CoPP und Hämin (Abb. 29) zu beobachten ist.
Dies kann in der Klinik z.B. bei der verstärkten Freisetzung von Hämoglobin in Folge von großflächigen Verletzungen, bei der es zu starken Blutungen und Hämolyse kommen kann, eine wichtige Rolle spielen. Freiem Hämprotein werden immunmodulatorische Eigenschaften zugeschrieben. Bis heute sind jedoch hauptsächlich proinflammatorische Effekte, wie die Induktion von proinflammatorischen Adhäsionsmolekülen, beschrieben [75] . Zudem wirkt Häm in hohen Konzentrationen durch die Generierung von reaktivem Sauerstoff (ROS = reaktive Sauerstoffspezies) cytotoxisch. Eine Studie aus dem Jahr 1996 weist jedoch auf eine immunhemmende Wirkung von Porphyrinen hin. Die Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass in Hämatoporphyrin- (ein Porphyrinmetabolit), Hämin- und Hämoglobin-behandelten
Diskussion
Peritonealmakrophagen der Maus die MHC-II-abhängige T-Zellaktivierung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen gehemmt ist [136] . Dies lässt sich durch eine Porphyrin-induzierte Hemmung der MHC-II-Expression erklären, welche in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte.
Freies Hämoglobin kann sowohl an Hemopexin als auch an Haptoglobin binden. Hemopexin zählt zu den Hämoglobin-Binde-Proteinen und ist für die Aufnahme von Hämoglobin via LPR (low density lipoprotein receptor-related protein) / CD91 zuständig. In humanen Hepatoma-Zellen zeigte sich, dass sowohl Hämprotein als auch CoPP an Hemopexin bindet. Allerdings führte der CoPP-Hemopexin-Komplex weder zu einer HO-1-Induktion noch zu einem Anstieg der intrazellulären CoPP-Konzentration in den Hepatoma-Zellen. Im Gegensatz dazu war nach der Inkubation mit freiem CoPP sowohl ein Anstieg der HO-1-mRNA als auch ein Anstieg der intrazellulären CoPP-Konzentration zu detektieren [137] . Hemopexin ist demnach nicht für die Aufnahme von CoPP in die Zelle verantwortlich. Das Bindeprotein spielt auch bei der Hämoglobin-Aufnahme nur eine untergeordnete Rolle. Als eigentliches Hämoglobin-Binde-Protein gilt das Plasmaprotein Haptoglobin, welches die Aufnahme von Hämoglobin über CD163, dem Hämoglobin-Scavenger Rezeptor, induziert. Der Hämoglobin-Haptoglobin-Komplex (HbHg) interagiert mit CD163, wodurch die Aufnahme des Komplexes durch Endozytose in die Zellen initiiert wird [80] . Allerdings wurde gezeigt, dass auch freies Hämoglobin an CD163 binden und in die Zelle aufgenommen werden kann. Dies scheint insbesondere bei hohen Plasmakonzentrationen von Hb von Bedeutung zu sein [79] . Nach der Aufnahme wird das Häm mit Hilfe der Hämoxygenase in CO, Bilirubin/Biliverdin und Ferritin degradiert. Dies bestätigt eine Studie mit humanen, aus Monozyten gereiften, Makrophagen, in der sowohl HbHg als auch freies Hb durch Interaktion mit CD163 endozytiert wurden und es zu einer Induktion der HO-1-Expression kommt [138] . CD163 wird hauptsächlich von Monozyten (und Makrophagen) exprimiert [86,122] , was durch die hier präsentierten Ergebnissen bestätigt wird (Abb. 27A). Über die weiteren intrazellulären Mechanismen, die durch eine Interaktion von HbHg mit CD163 induziert werden, ist bis heute jedoch nur wenig bekannt. Ritter et al. postulieren, dass die CD163-vermittelte Sekretion proinflammatorischer Zytokine von der Interaktion der intrazellulären Rezeptordomäne mit Casein-Kinase-II und PKC abhängt [139] . Zudem ist bekannt, dass die Interaktion von HbHg mit CD163 zu einer starken IL-10 Synthese führt [87] . Die hier präsentierten Daten zeigen, dass neben HbHg auch Hämin, jedoch nicht CoPP, die IL-10 Expression in human PBMC induziert (Abb. 28A). Das antiinflammatorische Zytokin IL-10 ist in der Lage die Expression von HLA-DR zu inhibieren [35,95,96] , so dass eine erhöhte IL-10-Expression besonders im Hinblick auf die verminderte monozytäre MHC-II-IL-10-Expression in Folge einer Porphyrin-Behandlung von Bedeutung sein kann. Allerdings zeigen die Ergebnisse, dass eine Neutralisation von IL-10 die Porphyrin-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression nicht
Diskussion
aufhebt (Abb. 28B), so dass von einem IL-10-unabhängigen Mechanismus ausgegangen werden kann.
CD163 ist ein 130kDa großer transmembraner Rezeptor, welcher aus neun SRCR (Scavenger Receptor Cysteine Rich) Domänen, einem Transmembranelement und einem kurzen cytoplasmatischen Schwanz besteht [81] . Für die Interaktion mit dem HbHg-Komplex scheint insbesondere die SRCR Domäne 3 essentiell zu sein. Eine proteolytische Spaltung dieser Domäne kann die Bindung von HbHg an den Rezeptor verhindern. Zudem kann durch Blockieren der SRCR Domäne 3 mittels eines spezifischen Antikörpers (Klon EDHu-1) die Bindung ebenfalls verhindert werden [124] . Unter der Annahme, dass die Porphyrin-vermittelten Effekte von einer Interaktion mit CD163 abhängen, sollte ein Blockieren des Rezeptors durch den Antikörper EDHu-1 die Porphyrin-induzierte Hemmung der HLA-DR-Expression aufheben. Der in dieser Arbeit zur Blockierung von CD163 verwendete Antikörperklon EDHu-1 war allerdings stark mit Endotoxin kontaminiert, wodurch es zu einer Verfälschung der Ergebnisse kommen kann. Endotoxine (Lipopolysaccharid=LPS, das Toxin gram-negativer Bakterien) sind sehr potente Immunmodulatoren und induzieren z.B. die Reifung von DC. Hohe Dosen von LPS können aber auch zu einer Desensibilisierung von Monozyten und DC führen, so dass diese auf weitere Stimuli nicht mehr reagieren [140,141] . Nach der Aufreinigung des Antikörpers hatte dieser selbst keinen Effekt mehr auf die HLA-DR-Expression (Abb. 29), was darauf hin deutet, dass die anfänglich beobachteten inhibitorischen EDHu-1-Effekte (Daten nicht gezeigt) durch die Endotoxin-Kontamination vermittelt wurden. Jedoch konnte mit dem Blockieren der CD163 SRCR Domäne 3 auch nicht die Hb-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression aufgehoben werden (Abb. 29).
Die Porphyrin-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression scheint also unabhängig von einer Interaktion mit CD163 zu sein. Die durch Hb-induzierte IL-10-Expression konnte jedoch ebenfalls nicht durch EDHu-1 aufgehoben werden (Daten nicht gezeigt). Entweder war die eingesetzte Antikörperkonzentration zu niedrig oder die Hb-induzierte IL-10-Synthese ist unabhängig von einer Interaktion mit der SRCR Domäne 3 des Rezeptors. Zur genauen Klärung dieser Frage wären daher weitere Versuche notwendig. So sollte z.B. untersucht werden, ob durch das Blockieren anderer CD163-Domänen die Hb-induzierte IL-10-Expression gehemmt werden kann.
Denkbar wäre hier die Verwendung des Antikörperklons RM3/1, welcher die SRCR Domäne 9 des Rezeptors blockiert. RM3/1 hemmt nur sehr schwach die Interaktion von HbHg mit CD163 [124] , blockiert jedoch nahezu vollständig die HbHg-induzierte IL-10-Synthese in humanen Makrophagen [87] . In dieser Arbeit konnte der Antikörper-Klon RM3/1 nicht verwendet werden, da der kommerziell erhältliche Antikörper zu stark mit Endotoxin [20ng/ml] kontaminiert war (z.Vgl.
EDHu-1: 0,0236ng/ml). Zudem sollte überprüft werden, ob die inhibitorischen Effekte weiterer Porphyrine wie CoPP und Hämin auf die MHC-II-Expression ebenfalls nicht durch CD163-Blockade beeinflusst werden. Auch eine mögliche Kreuzvernetzung und Aktivierung des
Diskussion
Rezeptors durch den CD163 Antikörper muss in Betracht gezogen werden. So zeigte eine Studie, dass eine Behandlung von humanen Makrophagen mit EDHu-1 zu einer gesteigerten 6- und IL-1β-Sekretion führt, welche mit einer EDHu-1-vermittelten Kreuzvernetzung von CD163 erklärt wurde [142] . Allerdings scheint ein solcher Effekt zumindest in den vorliegenden Untersuchungen keine Rolle bei der Inhibition MHC-II-Expression gespielt zu haben, da die in Abb. 29 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper in der verwendeten Konzentration alleine keinen Einfluss auf die konstitutive HLA-DR hat.