RNA Nachweis aus Filtermaterial

Für eine Reihe von Fragestellungen wäre es wünschenswert, wenn aus Filter-getrocknetem Material nicht nur die Antikörper, sondern auch die HIV-RNA quantifiziert und die pol-Sequenz zur Resistenzbestimmung ermittelt werden könnte.

Aus Vorversuchen und Publikationen war bekannt, dass die Stabilität der viralen RNA möglicherweise ein Problem darstellt. Wichtig war daher, wie sensitiv sich RNA in getrocknetem Probenmaterial nachweisen lässt und welche Lagertemperaturen geeignet sind. In der Literatur gab es widersprüchliche Angaben, ob eine Lagerung der Filter-getrockneten Proben bei Raumtemperatur ausreicht [132] oder ob bei einer längeren Lagerung bei Raumtemperatur die RNA degradiert [167].

Die ersten vier Verdünnungsstufen des Konzentrationsstandards (2.2.3) wurden auf Filterscheiben getropft. Die Filter wurden 12 Stunden getrocknet und anschließend bei Raumtemperatur, -20°C und -70°C gelagert.

Vor dem Einfrieren der Filter wurde als Null-Wert die RNA aus den Filterscheiben extrahiert. Die weiteren Extraktionszeitpunkte waren nach einer Woche, nach vier Wochen, nach drei Monaten und nach sechs Monaten.

Aus der extrahierten RNA wurde die cDNA synthetisiert (2.4.5) und die Inhaus-pol RT-PCR (2.4.6) durchgeführt sowie die Viruslast mit der quantitativen Real-time LTR-RT-PCRbestimmt (2.4.8).

Für die Amplifizierung des pol-Fragmentes zur Resistenzbestimmung sind nur die Daten der ersten drei Verdünnungsstufen gezeigt (Tab. 13). Die Nachweisgrenze lag bei dieser Methode bei 1x10³ Genomkopien/ml Plasma. Die vierte Verdünnung lag mit rechnerisch maximal 3,4x10² eingesetzten Genomkopien demnach unter der Nachweisgrenze der Inhaus-pol RT-PCR. Virale RNA war in dieser Probe auch nicht mehr nachweisbar.

Die Amplifikation des pol-Fragmentes aus den Filterproben war auch nach 180 Tagen Lagerzeit noch möglich (Tab. 13). Allerdings zeigte sich vor allem bei niedrigen Kopienzahlen, dass die Amplifikation des pol-Fragmentes von den bei Raumtemperatur gelagerten Filtern schwieriger ist.

Nach sechs Monaten Lagerzeit war das pol-Fragment nur noch aus einem der beiden bei Raumtemperatur gelagerten Filter amplifizierbar (Tab. 13), so dass sich für die genotypische Resistenztestung aus Filterproben eine Lagerung der Proben bei ≤ -20°C als geeignet erwies.

Tab. 13:Amplifikation des HIV-1-pol-Fragmentes aus Filter-getrockneten Plasmaproben bei verschiedener Lagertemperatur und Lagerdauer

Lagerdauer (Doppelwerte pro Zeitpunkt) Ausgangswert

[gk/PCR]

Lagertemp Null-Wert

Vor dem Einfrieren

7 Tage 4 Wochen 3 Monate 6 Monate 3,4x10⁵ RT Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Neg./Neg.

3,4x10⁵ -20°C -. Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos.

3,4x10⁵ -70°C - Pos./Pos. Pos./Pos. Neg./Neg. Pos./Pos.

3,4x10⁴ RT Pos./Pos. Neg./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Neg./Neg.

3,4x10⁴ -20°C - Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos.

3,4x10⁴ -70°C - Neg./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos.

3,4x10³ RT Neg./Pos. Neg./Neg. Neg./Pos. Pos./Pos. Neg./Pos.

3,4x10³ -20°C - Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos.

3,4x10³ -70°C - Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos. Pos./Pos.

[gk/PCR] = Genomkopien pro PCR-Ansatz; Pos. = Fragment amplifizierbar; Neg. = Kein Fragment amplifizierbar

Diese Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse von McNulty et al. (2005), die ebenfalls nur aus bei -20°C oder -70°C gelagerten Proben (Lagerzeit über fünf Jahre) eine Resistenztestung erfolgreich durchführen konnten, jedoch nicht aus den bei Raumtemperatur gelagerten Proben [167].

Die Viruslast war in allen 78 Filterproben messbar. Die Nachweisgrenze der Real-time LTR-RT-PCR zur Viruslastbestimmung aus frischem Plasma lag bei 1x10² Genomkopien/ml Plasma.

Nach sechs und teilweise schon nach drei Monaten Lagerung lag die Viruslast der bei Raumtemperatur gelagerten Filterproben um eine Zehnerpotenz niedriger als die der bei -20°C und -70°C gelagerten Filterproben (Abb. 30). Zum Beispiel wurde für die erste Verdünnungsstufe mit einem Ausgangswert von 3,4x10⁵ nach 180 Tagen Lagerzeit von den bei Raumtemperatur gelagerten Filter eine Viruslast von im Mittel 2,4x10⁴ (± 3,8x10³) gemessen, während für die bei -20°C und -70°C gelagerten Filter je 1,4x10⁵ Genomkopien/PCR gemessen wurden (± 4x10⁴ und ± 1,7x10⁴; Abb. 30).

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Abb. 30: Viruslast in Filter-getrockneten Proben bei verschiedenen Lagerzeiten und Lagertemperaturen

Gezeigt sind jeweils MW und STABW über 4 Messungen für jeweils die Ausgangswerte A) 3,4x10⁵ Genomkopien/PCR; B) 3,4x10⁴ Genomkopien/PCR, C) 3,4x10³ Genomkopien/PCR.

Diese Ergebnisse zeigen, dass Viruslastmessungen und genotypische Resistenzbestimmung aus Filter-getrocknetem Material möglich sind, auch wenn es aufgrund der getropften Ausgangsmenge (30µl Tropfvolumen) Limitierungen in der Anzahl nachweisbarer Genomkopien gibt. Sowohl für die Viruslast- als auch für die Resistenzbestimmung liegt die optimale Lagertemperatur der Filterproben bei

≤ -20°C.

4 Diskussion

Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war die Etablierung einer Methode zur Unterscheidung zwischen inzidenten und prävalenten HIV-Infektionen anhand gut charakterisierter Proben (Referenzprobenpanel, RPP). Eine der etablierten Methoden (der BED-ELISA) wurde an einem Probenpanel in der Pilotstudie zur Untersuchung der HIV-Inzidenz in Berlin validiert. Mit der Pilotstudie sollte die Realisierbarkeit einer nationalen Inzidenzstudie geprüft werden.

Es wurden zwei Methoden, die verschiedene Parameter der HIV-spezifischen Antikörperantwort erfassen, etabliert. Mit der ersten Methode, dem BED-ELISA, wird das Verhältnis an HIV-spezifischen Antikörpern im Vergleich zu den gesamt IgG-Antikörpern gemessen. Mit der Aviditäts-Methode wird die Bindungsstärke der spezifischen Antikörper bestimmt. Beide Methoden sind dazu geeignet, frische HIV-Infektionen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zu erkennen [111, 121]. Im Rahmen einer Kooperation mit Francis Barin wurde das RPP in einem dritten Inzidenz-ELISA, dem IDE-V3, getestet [114]. Dieser Test ist ein Peptid-ELISA, mit dem spezifische Antikörper gegen mehrere HIV-Antigene gleichzeitig nachgewiesen werden. Mit diesen Methoden wurden bereits Inzidenzstudien durchgeführt [128, 168-176].

Die Erhebungen von Inzidenzdaten sind in der Regel aufwendig, da umfassende und teure Verlaufsstudien in großen Kohorten erforderlich sind. Labormethoden, mit denen die Dauer der HIV-Infektion im Patienten eingegrenzt werden kann, sind aus epidemiologischer Sicht daher wertvoll, da sie Kohortenstudien teilweise ersetzten könnten.