RNA-Microarray

Es ist anzunehmen, dass den unter 5.3.2 beschriebenen pathologischen Unterschieden sowie dem scheinbar aggres-siveren Wachstum beider genotypspezifischen Tumore charakteristische molekularbiologische Verschiedenheiten zugrunde liegen. Diese sollten sich auch auf transkriptioneller Ebene widerspiegeln. Um diese Veränderungen zu analysieren, wurden RNA-Microarray-Studien durchgeführt, welche Einsicht in nahezu das komplette Transkrip-tom erlauben.

Jeder intestinale Tumor im APCmin-Modell stellt ein singuläres Ereignis dar. Ausgehend vom dem Kinzler-Vogelstein-Modell führte die fehlende APC-Expression in einer Darmzelle zur neoplastischen Veränderung, welche weitere wachstumsfördernde Mutationen anreichert (somatische Evolution). Um die hierbei auftretenden tumorin-dividuellen Eigenarten zu minimieren und generelle Unterschiede in der Genexpression eruieren zu können, wurde mit einem Pool gleichartiger Tumore gearbeitet. Zur Verringerung weiterer externer Einflüsse wurden die Tumore aus Tieren des gleichen Wurfs und Geschlechts isoliert. Da die pathologischen Unterschiede im distalen Dünn-darmabschnitt (DüDa III) am deutlichsten waren, wurde nur auf Tumore dieses Abschnitts zurückgegriffen.

Der geringe Kontrast im frischen Darmgewebe zwischen normalem Darmepithel und Tumor erlaubte keine saubere Präparation. So erwies es sich als hilfreich, den Darm zuerst in RNAse-hemmendem Puffer zu konservieren, um im Anschluss die Tumore zu isolieren. Bei der Präparation wurde darauf geachtet, nur Tumore gleicher Größe zu poolen. Die RNA wurde mittels der GTC-Methode extrahiert und zusätzlich über RNA-Säulen (Qiagen, Hilden) gereinigt. Die Biotinylierung wie auch Hybridisierung auf den Microarray-Chip wurden vom Labor für Funktio-nelle Genomforschung (LFGF) der Charité, Berlin, (Dr. U. Ungethüm) vorgenommen. Pro Genotyp wurde ein Pool aus 8 bis 10 Tumoren auf jeweils einem RNA-Microarray (GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array, Affy-metrix, Santa Clara, CA, USA) hybridisiert. Dieser Chip ermöglichte einen Überblick über 39.000 ESTs, repräsen-tierte also 45.000 PS.

Die Normalisierung der Signale auf zuerst alle Hybridisierungsereignisse und im Anschluss auf ein Set von „Hou-sekeeping“-Genen wurde vom Service-Zentrum der Charité (Dr. Kuban, LFGF der Charité) durchgeführt.

In einem ersten Schritt konnte von den 45.000 PS annähernd die Hälfte (genau 17.143 PS) ausgeschlossen werden, da in keinem der beiden Genarrays signifikante Signalstärken (p > 0,05 in PS) zu verzeichnen waren. Hierbei han-delte es sich vorwiegend um gewebeunspezifische Gene, die in den Tumoren nicht in ausreichender Menge detek-tiert werden konnten und somit vermutlich kaum im Darm exprimiert sind.

Abbildung 5.15 zeigt die Signalintensitäten der nicht normalisierten Probesets gegeneinander aufgetragen. Hierbei wird der große dynamische Bereich deutlich, welcher durch die Hybridisierung abgedeckt wurde.

Die Hybridisierung beider Chips erfolgte in ähnlicher Qualität. Dies lässt sich aus der Steigung von 1,04 der Kor-relationsgeraden der Rohdaten (nicht normalisiert) herauslesen. Die Scatterplot-Darstellung veranschaulicht zu-sätzlich die hohe Ähnlichkeit beider Genprofile.

Abbildung 5.15: Scatterplot der Microarrays: Korrelation der nicht normierten Signale der GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Für jedes Hybridisierungsexperiment wurde die RNA aus 8 bis 10 Tumoren gepoolt. Die Scatterplot-Darstellung veranschaulicht, dass beide Hybridisierungen von vergleichbarer Qualität waren.

Diese Ähnlichkeit wird noch deutlicher, wenn man nur die Genexpressionsveränderung graphisch gegeneinander stellt. Abbildung 5.16 zeigt die Expressionsänderung der APC^Min/+/SePP^+/-- gegen die APC^Min/+-Tumore. Nur ca.

12 % der Probesets sind mindestens um den Faktor 1,5 unterschiedlich reguliert und nur 4 % sind um mehr als das Doppelte reguliert.

Abbildung 5.16: Spektrum der Expressionsänderung der Tumore in Abhängigkeit von SePP: Die normierten Sig-nalstärken der Genarray-Hybridisierungen wurden zueinander ins Verhältnis gesetzt. Zur graphischen Auswertung wurden nur die tatsächlich exprimierten Gene verwendet (Detection p-Value < 0,05). Beide Tumorarten (APC^Min/+, APC^Min/+/SePP^+/-) zeigten nur geringe Expressionsunterschiede. Von den 28.000 exprimierten Probsets (PS) sind lediglich 4 % um den Faktor >2 reguliert.

Angesichts dessen, dass beide Tumorpools trotz unterschiedlicher Morphologie ein sehr ähnliches Expressions-muster zeigten, wurde eine Expressionsänderung um mindestens den Faktor 1,5 als Auswahlkriterium zur weiteren Analyse und ggf. Verifikation definiert. So konnten 24.604 Probensets ausgeschlossen werden. Von den verbliebe-nen 3354 Probesets waren im SePP^+/--Tumorpool gegenüber dem Wildtyp-Tumorpool 1769 unter- und 1585 hoch-regulierte Gene zu finden.

Ausgehend von einer intensiven Literaturrecherche wurden aus den verbleibenden Probensets diejenigen Gene ausgewählt, die vermutlich im Hinblick auf Tumorigenese, Wachstum oder das Spurenelement Selen reguliert waren.

Nachfolgend eine Liste von potentiell in der selenabhängigen Tumorigenese bedeutsamen Kandidaten-Genen mit Literaturangaben:

Tabelle 5.1: Literaturrecherche zu differentiell exprimierten Kandidatengenen aus den Microarray-Analysen: Gene, welche sich im Microarray als reguliert zeigten (Fold change, FC), wurden mittels Literaturrecherche auf ihre Relevanz für die Tumorigenese oder den Selenstoffwechsel untersucht.

FC Gen Literatur

12,7 A disintegrin and metallopeptidase domain 21 (Adam21) (Gavert, et al., 2005)

7,9 Connective tissue growth factor (Ctgf) (Luo, et al., 2004: ; Paoni, et al., 2003) 6,9 Fibroblast growth factor 17 (Fgf17) (Nezu, et al., 2005)

3,8 Serum amyloid A 1 (Saa1) (Gutfeld, et al., 2006)

2,7 Interleukin 6 (Il6) (Atreya and Neurath, 2005: ; Brozek, et

al., 2005)

2,6 Serum amyloid A 2 (Saa2) (Gutfeld, et al., 2006: ; Paoni, et al., 2003) 2,2 Myeloblastosis oncogene (Myb) (Biroccio, et al., 2001: ; Ramsay, et al.,

2005) 1,9

Bcl2-like 1 (Bcl2l1)

(Paoni, et al., 2003: ; Sulkowski, et al., 2006)

1,8 Mast cell protease 2 (Mcpt2) (Miller and Pemberton, 2002: ; Norkina, et al., 2004: ; Paoni, et al., 2003)

1,8 Cyclin C (Ccnc) (Bondi, et al., 2005)

1,7 Cell death-inducing DNA fragmentation factor, alpha subunit-like effector A (Cidea)

(Paoni, et al., 2003)

1,7 Carboxypeptidase A3, mast cell (Cpa3) (Paoni, et al., 2003) 1,6 Angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5 (Ang1) (Etoh, et al., 2000) 1,6 Jun proto-oncogene related gene d1 (Jund1) (Behrens, 2000)

1,6 Insulin-like growth factor I receptor (Durai, et al., 2005), (Sachdev, et al., 2004) 1,5 Mast cell protease 1 (Mcpt1) (Miller and Pemberton, 2002: ; Paoni, et

al., 2003)

1,5 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) (Dinkova-Kostova, et al., 2002)

1,5 Peroxisome proliferator activated receptor gamma (Pparg) (Heikkinen, et al., 2007: ; Paoni, et al., 2003: ; Voutsadakis, 2007)

1,5 Serum amyloid A 3 (Saa3) (Gutfeld, et al., 2006: ; Paoni, et al., 2003) 1,4 Metallothionein 2 (Mt2) (Haq, et al., 2003) (Cherian, et al., 2003) 1,4 Metallothionein 1 (Mt1) (Haq, et al., 2003) (Cherian, et al., 2003) 0,8 Selenoprotein P (SePP) (Al-Taie, et al., 2004: ; Mork, et al., 2000)

(Paoni, et al., 2003)

0,6 Tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (Timp2) (Sounni, et al., 2003) (Paoni, et al., 2003) 0,6 Cyclin D binding myb-like transcription factor 1 (Dmtf1) (Inoue, et al., 2007) (Sreeramaneni, et al.,

2005) (Paoni, et al., 2003)

0,6 Claudin 1 (Cldn1) (Paoni, et al., 2003)

0,6 Procollagen, type IV, alpha 5 (Col4a5) (Li, et al., 2005) 0,5 Endothelin receptor type B (Ednrb) (Paoni, et al., 2003) 0,3 Trans-acting transcription factor 4 (Sp4) (Paoni, et al., 2003)

0,2 Growth differentiation factor 10 (Gdf10) (Luo, et al., 2004) (Paoni, et al., 2003)