RNA-Methoden

3.3.1 RNA-Isolierung (total-RNA Präparation)

Alle in diesem Protokoll genannten Mengenangaben beziehen sich auf eine Gewebemenge von 100mg oder 1*10⁷ Zellen, und somit müssen alle Volumenangaben an die vorhandenen Gewebemengen angepasst werden. Gewebe oder Zellen wurden nach der Isolierung sofort in flüssigem Stickstoff gefroren, um den Degradationsprozess durch RNasen zu minimieren. Bei der Durchführung des Protokolls wurde stets darauf geachtet, Kontaminationen mit RNase zu vermeiden, d.h. es wurden z.B. RNase-freie Lösungen und Plastikwaren eingesetzt.

Pro 100mg gefrorenen Gewebes wurde 1ml Denaturierungslösung (4M Guanidinium-Thiocyanat; 25mM Na-Citrat pH7.0; 0,5% Na-Sarcosyl (v/v); 0,1M β-Mercaptoethanol) zugegeben, und anschließend wurde das Gewebe mit einem Ultra-Turrax homogenisiert. Danach wurden 1ml Phenol, 0,2ml CHCl3/Isoamylalkohol (49:1) und 0,1ml 2M Na-Acetat pH4.0 zugegeben und gründlich geschüttelt. Bei 10000g wurde 20min in der Sorvall RC5b Kühlzentrifuge (4°C) zentrifugiert und die obere, wässrige Phase in ein neues Greinerröhrchen gegeben. Um die RNA zu fällen, wurde ein Volumen Isopropanol (oder 3 Volumen Ethanol) hinzugegeben und über Nacht bei –20°C inkubiert. Die RNA wurde 15min bei 10000g abzentrifugiert

aufgenommen, in ein Eppendorfgefäße überführt und durch Zugabe von einem Volumen Isopropanol (alternativ 3 Volumen Ethanol) für 1 Stunde bei -80°C gefällt.

Bei 4°C wurde die RNA für 15min in der Eppendorfzentrifuge (13000rpm) pelletiert, der Überstand verworfen und das Pellet mit 0,5ml 70% Ethanol (-20°C) gewaschen, um β-Mercaptoethanol-Rückstände zu beseitigen. Nun wurde zum Auswaschen von Salzen noch einmal 0,5ml 70 % Ethanol zugegeben, 15min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend erneut abzentrifugiert. Nachdem der Überstand vollständig abgesaugt worden war, wurde das Sediment luftgetrocknet. Anschließend wurde die RNA in 100μl DEPC-H2O (0,1% DEPC in H2O, über Nacht (ü/N) inkubieren und zweimal autoklavieren) aufgenommen und für 10min bei 65°C im Thermoschüttler resuspendiert. Sollte die RNA für eine miRNA-microArray Hybridisierung bei der Firma Miltenyi eingesetzt werden, wurde die Qualität der RNA im Gerät 2100Bioanalyzer der Firma Agilent ermittelt.

3.3.2 Transfer von RNA auf Membranen (Northern Blot)

Für den Nachweis der Expression von miRNAs in Zellen oder Geweben wurden die RNA-Proben zunächst in einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Für ein Gel mit den Abmessungen 12cmx15cmx0,8mm benötig man ca. 20ml denaturierende PAA-Lösung, die man mit 20µl TEMED und 200µl 10%APS für die Polymerisation versetzt und schüttelt, und anschließt damit das Gel gießt. Nach einstündiger Auspolymerisation ließ man das Gel für 30 Minuten in 1xTBE bei 19mA vorlaufen. Vor dem Beladen des Gels wurden die Probentaschen sehr gut ausgespült. Die Probenvorbereitung erfolgte durch Fällen oder Eindampfen von ca.

30µg RNA-Probe, die anschließend in 20µl RNA-Probenpuffer für 10 Minuten unter schütteln resuspendiert wurde. Anschließend wurden die Sekundärstrukturen durch Inkubation bei zunächst 10 Minuten bei 65°C und anschließend für 5 Minuten auf Eis aufgebrochen. Nach dem Beladen des Gels, ließ man die Proben für ca. 10 Minuten bei 10mA in das Gel einlaufen. Die Auftrennung erfolgte für ca 2,5 Stunden bei 20mA. Um die Qualität der RNA und des Gellaufs beurteilen zu können, wurde das Gel anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt und analysiert. Der Transfer auf eine Nylonmembran (Hybond N+, Amersham) erfolgte nach dem Semy-Dry-Elektroblot-Verfahren. Hierzu wurden Whatmanpapier und Nylonmembran auf die Gelgröße zurechtgeschnitten, durch TBE befeuchtet und anschließend wie folgt gestapelt, wobei die Reihenfolge von Anode zu Kathode beschrieben wird; 3 Lagen

Whatmanpapier, Nylonmembran, Gel, 3 Lagen Whatmanpapier. Der Transfer erfolgte für 35 Minuten bei einer Stromstärke von 3,3 mA pro cm² Membran und die Fixierung bei 10mJ/cm² und für 30 Minuten bei 80°C.

PAA-Lösung für 60 ml 10xTBE RNA-Probenpuffer 25,2g Harnstoff

22,5ml 2%Bis-, 38%Acrylamid 6ml 10xTBE

10,5 ml H2O

aus Short Protocols in Molecular Biology

0,09M TrisCl pH8.0 0,09M Borsäure 2mM EDTA

8M Harnstoff

0,1% Bromphenolblau 0,1% Xylenyyanol In TBE

3.3.3 Radioaktive Markierung von Oligonukleotid-Sonden am 5´Ende

Für die Detektion wurden DNA-Oligonukleotid-Sonden verwendet, ggf. auch LNA- Oligonukleotid-Sonden (locked nucleic acid) der Firma Exiqon um eine höhere Sensitivität und Spezifität zu erreichen. Die Markierung erfolgte über den Transfer des radioaktiv markierten γ-Phosphates der Substanz γ³²-ATP (Amersham) auf das 5´Ende des Oligonukleotids. Der Reaktionsansatz wurde wie folgt zusammengegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

5´Labeling

1µl Oligonukleotid (20pmoles/µl) 5µl γ³²-ATP

1µl T4 Polynukleotidkinase (MBI Fermentas) 5µl 10x T4 forward Puffer

38µl H2O

Die Aufreinigung erfolgte wie in 3.2.17 beschrieben mit ProbeQuant^™ G-50 oder G25 Micro Columns (Amersham).

3.3.4 Hybridisierung und Detektion von Northern Blots

Der Ablauf ähnelte dem der Hybridisierung von Southern-Blots sehr (3.2.18).

Die Nylonmembranen wurden zusammen mit 6ml vorgewärmten Hybridisierungpuffer Perfecthyb^™ Plus (Sigma-Aldrich) und denaturierter Heringssperma-DNA, in

Hybridisierungsröhren gegeben und für 30 Minuten bei 40°C prehybridisiert. Nach Zugabe der radioaktiv markierten Sonde erfolgte die Hybridisierung über Nacht. Tags darauf wurden die Membranen zunächst mit 2xSSC 0,1%SDS (siehe 3.2.16) für 30 Sekunden, dann mit 2xSSC 0,1%SDS für 10 Minuten und zuletzt mit 1xSSC 0,1%SDS für 3 Minuten gewaschen, und anschließend wurde das Ergebnis wie in 3.2.18 beschrieben dokumentiert. Sollten die Membranen erneut für eine Hybridisierung einer anderen Sonde eingesetzt werden, so wurden sie so oft mit 90°C warmer 1%iger SDS-Lösung für 5 Minuten geschüttelt, bis der Szintilator keine Radioaktivität mehr auf den Membranen feststellen konnte. Anschließend wurden sie 3x für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1xSSC gewaschen und anschließend trocken gelagert.

3.3.5 Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

Bei der reversen Transkription (RT) stellt man mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) aus RNA copy-DNA (cDNA) her. Diese wurde in einer nachfolgenden PCR auf bestimmte Transkripte qualitativ untersucht oder durch qRT-PCR im Lightcycler (siehe) quantitativ betrachtet. Für die RT-Reaktion wurden verschiedene Reverse Transkriptasen verwendet. Neben der Transcriptor RT (Roche), der AMV RT (Invitrogen) fand das Omniscript RT Kit (Qiagen) häufig Verwendung. Die verschiedenen Reversen Transkriptasen unterscheiden sich in der Reaktionstemperatur. So kann man z.B. die Transcriptor RT bei 55°C inkubieren, was im Falle von sehr GC-reichen RNAs große Vorteile hat, da weniger Sekundärstrukturen die Reaktion behindern. Beispielhaft sei hier die Reaktion für die QIAGEN Omniscript RT angegeben. Für eine Reaktion nimmt man 2µg Gesamt-RNA in 10µl DEPC-H2O und gibt 10µl des folgenden Mastermixes hinzu: 1µl RNasin, 1:4 verdünnt (Promega), 0,5µl polyT-Primer (0,5µg/µl), 2µl RT-Puffer, 2µl dNTPs (5µM), 1µl Omniscript RT, und 3,5µl DEPC-H2O. Danach erfolgte eine Inkubation bei 37°C für 60 bis 90 Minuten. Anschließend wurde eine Hitzedenaturierung der RT bei 95°C für 15 Minuten durchgeführt. Falls sehr lange Produkte erwünscht waren, wurde dieser Schritt übersprungen. Für qualitative Betrachtungen wurde in der Regel 1µl des RT-Reaktionsgemisches für eine nachfolgende PCR eingesetzt.

3.3.6 Quantitative Realtime-PCR (qRT-PCR)

Mit Hilfe des LightCycler Systems (Roche) wurde eine Quantifizierung von Transkriptmengen in der online PCR von Transkriptmengen unter Verwendung des Farbstoffs SYBR Green I (QIAGEN) durchgeführt. Der Farbstoff interkaliert in doppelsträngige DNA und die Menge des PCR-Produktes konnte über die Fluoreszenzzunahme bei 521nm bestimmt werden. Hierzu wurde der Wendepunkt (crossing point) in der log-Phase der sigmoiden Fluoreszenzkurve jeder Probe bestimmt. Die ideale Produktgröße in der online PCR liegt zwischen 150 und 200bp.

Beim Primerdesign ist, wenn möglich, auf dieses Kriterium geachtet worden. Die Ansätze wurden immer als Doppelbestimmung (Technisches Replikat) durchgeführt um Pipettierfehler und andere Schwankungen zu minimieren. Der verwendete Standard-Ansatz sah folgendermaßen aus: 20μl Sybr Green MasterMix, je 0,4μl Primer (50μmol/μl), 17,2μl H2O und 2μl Template (Standard RT-Ansatz, siehe 3.3.5).

Von diesen 40μl sind je 18,5μl in eine für den Lightcycler vorgesehende Glaskapillare (Roche) gegeben worden. Nach Zentrifugieren bei 1000g für 1 Minute wurde das Gerät beladen und gestartet. LightCycler PCRs wurden nach folgendem Standard-Programm durchgeführt. Während einer initialen Denaturierung von 95°C für 15 Minuten wurde die Polymerase aktiviert. Es schlossen sich bis zu 50 Zyklen mit 20 Sekunden und 94°C Denaturierung, 20 Sekunden 58°C Annealing und 15 Sekunden 72°C Elongation an. Im Anschluß an die letzte Elongationsphase führte das Gerät eine Schmelzkurvenanalyse durch, so dass Ergebnisse ohne Nebenprodukte identifiziert und ausgewertet werden konnten. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte gegenüber einem internen Standard, meist β-Aktin. Hiermit wurde die Transkriptmenge normalisiert. Es wurden generell Ansätze von drei biologischen mit je zwei technischen Replikaten gemessen. Zur Berechnung der normalisierten Transkriptmenge von Wildtyp und Mutante wurde folgende Formel verwendet:

ΔCT = CT (Gen A in Gewebe X) – CT (Gen N in Gewebe X)

Die ΔCT Werte (certain threshold level) wurden so aus den Messungen für β-actin (Gen N) und das zu untersuchende Gen (Gen A) ermittelt. Die drei Messwerte für den Wildtyp wurden gemittelt und genau wie die drei Wobbler-Messwerte nach folgender Formel in relative Transkriptmengen (X) umgerechnet: X = 2^-ΔCt

Die relativen Transkriptmengen der Mutante wurden anschließend durch die Werte des Wildtyps geteilt und so zueinander in Verhältnis gesetzt.

Für die Quantifizierung von miRNAs wurde das System der Firma Applied Biosystems verwendet. Hierbei erfolgt die reverse Transkription mit einem miRNA spezifischen Primer aus 1-100ng Gesamt-RNA. Der Reaktionsansatz wurde nach Angaben des Herstellers angesetzt. Die real time Quantifizierung der PCR erfolgte nicht durch die Fluoreszenz-Messung eines interkalierenden Farbstoffs, sondern nach dem Taq-Man-Prinzip. Hierbei liegt in dem PCR-Ansatz eine miRNA-spezifische Sonde vor, welche am 3´Ende mit einem Fluoreszenzmarker gekoppelt ist. Ist die Sonde frei in Lösung, verhindert ein Quencher, der an das 5´Ende der Sonde gekoppelt ist, eine Anregung des Farbstoffs und somit die Fluoreszenz.

Bindet die Sonde während der Amplifikation spezifisch an ihre Zielsequenz, so wird die Sonde nukleolytisch gespalten und somit der Farbstoff räumlich von dem Quencher getrennt. Das führt dazu, dass der Fluorenszenzfarbstoff zur detektierbaren Lichtemission angeregt werden kann.

3.3.7 5`RACE

3.3.7.1 5´RACE mit Hilfe des Systems von Roche

Die Methode der 5´-RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) wurde zur Bestimmung der miRNA vermittelten Spaltstelle im Vimentingen, unter Verwendung des 5´/3´RACE Kit, 2nd Generation ™ der Firma Roche Diagnostics, verwendet.

Die isolierte Gesamt-RNA wurde, unter Zuhilfenahme eines genspezifischen Primers (Sp1), direkt in einer reversen Transkription in cDNA umgeschrieben. Nach dem Verdau der RNA wurde mittels terminaler Transferase ein poly-A-Schwanz an das 3´-Ende der neu synthetisierten cDNA synthetisiert. Diese poly-A-cDNA wurde mittels PCR amplifiziert. Dafür wurde zum Einen ein poly-dT-anchor-Primer und zum Anderen ein genspezifischer Primer (Sp2) verwendet. Das resultierende PCR-Produkt wurde in den Vektor pJet1 kloniert und anschließend zur Bestimmung der Spaltposition sequenziert.

Die Durchführung erfolgte exakt wie im mitgeliefertem Handbuch beschrieben.

3.3.7.2 5´RACE mit Hilfe einer Adapterligation

Eine Alternative zu dem 5´RACE-System der Firma Roche ist die Ligation eines Adapters an endständige 5´Phosphate eines RNA-Fragments. Hierzu wurde folgender Reaktionsansatz pipettiert.

Reaktionsansatz für die RNA-Adapterligation 10µg Gesamt-RNA

2,0 µl RNA-Adapter (300ng/µl)

2,0 µl T4-RNA_Ligase (New England Biolabs) 2,0 µl T4-RNA_Ligase-Puffer

0,5 µl RNase-Inhibitor (MBI-Fermentas)

x µl RNase-freies H2O für ein Gesamtvolumen von 20 µl

Für die Ligation wurde der Ansatz für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte die reverse Transkription (siehe 3.3.5) mit 9,5µl des Reaktionsansatzes und einem genspezifischen Primer. Anschließend wurde eine leicht angewandelte Standard-PCR mit dem genspezifischen Primer, dem 5´Adapter-Outer-Primer durchgeführt und 2µl der cDNA. Die Abwandlung bestand darin, dass die Annealing-Temperatur im erstens Amplifikationsschritt 70°C betrug und für 20 Zyklen jeweils um 0,5°C gesenkt wurde. Danach erfolgten weitere 10 Zyklen mit einer Annealing-Temperatur von 60°C. In einer 2. PCR wurden 1µl der 1. PCR als Template sowie ein zweiter genspezifischer Primer und der 5´Adapter-Inner-Primer bei gleichem Amplifikationsprogramm eingesetzt. Anschließend wurden die PCR-Fragmente in den Vektor pJet1 kloniert (3.2.12) und sequenziert (IIT).