Arbeiten mit RNA

Wegen möglicher Kontaminationen mit schwer zu inaktivierenden RNasen waren beim Arbeiten mit RNA besondere Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten. Wässrige Lö-sungen wurden mit DEPC-behandeltem Wasser angesetzt, Kästen für Pipettenspit-zen über Nacht in DEPC-haltigem Wasser eingelegt und anschließend autoklaviert und die RNA-Präparationen unter dem Abzug durchgeführt. Beim Arbeiten wurden generell Handschuhe getragen und alle Arbeitsschritte, soweit nicht anders aufge-führt, auf Eis verrichtet.

Diethylpyrocarbonat (DEPC) ethyliert und inaktiviert dadurch Proteine. Hierzu wurde H2O mit 0,1% DEPC (v/v) kräftig vermischt und über Nacht bei RT inkubiert. Danach wurde das DEPC durch Autoklavieren zerstört, da es sonst nachfolgende enzymati-sche Reaktionen inhibiert hätte.

2.2.5.1 Isolation der Gesamt-RNA aus Säugerzellen

Zur Präparation der Gesamt-RNA aus L6-Zellen wurde das TRIzol-Reagens der Firma Gibco-BRL verwendet. Es handelt sich dabei um eine Mischung aus Phenol und Guanidiniumisothiocyanat und stellt eine Weiterentwicklung der von Chomzynski und Sacchi 1987 beschriebenen Ein-Schritt-RNA-Isolationsmethode dar (Chomzynski & Sacchi 1987). Sie beruht auf der Eigenschaft vo n RNA, in einer sauren (pH 4) 4 M Guanidiniumisothiocyanatlösung in Anwesenheit einer organischen Phe nol/Chloroform-Phase wasserlöslich zu bleiben, während sich Proteine, DNA und Fette in der organischen Phase und der Interphase befinden.

Guanidiniumisothiocyanat ist eine der stärksten proteindenaturierenden Agentien.

Seine Anwendung wurde ursprünglich entwickelt, um RNA aus Zellen mit hohem RNase-Gehalt zu isolieren (Chirgwin et al., 1979).

Nachdem das Medium abgesaugt war, wurden pro

50 ml Kulturflasche und 6 cm Kulturschale 1 ml TRIzol

94 mm Kulturschale 2 ml TRIzol

145 mm Kulturschale 5 ml TRIzol

auf dem Zellrasen homogen verteilt. Das Zellysat wurde mehrfach resuspendiert und jeweils 1 ml in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Nach der folgenden Inkuba-tion für 5 min bei RT wurden pro ml eingesetztem TRIzol 0,2 ml Chloroform zugege-ben, die Mischung für 15 sek heftig geschüttelt und 3 min bei RT stehengelassen.

Danach erfolgte eine Zentrifugation für 15 min bei 4 °C und 13000 UpM in der Tisch-zentrifuge, in dessen Verlauf die Mischung in eine untere organische Phase, eine In-terphase und eine obere wässrige Phase separiert wurde, die die zu isolierende RNA enthielt. Die obere Phase wurde abgezogen und die RNA durch Zugabe von 0,5 ml Isopropanol pro ml eingesetztem TRIzol präzipitiert. Nach einer zehnminütigen Inkubation bei RT erfolgte eine Zentrifugation für 10 min bei 4 °C und 13000 UpM in der Tischzentrifuge. Anschließend wurde die RNA mit 75%igem Ethanol gewaschen, 15 min an der Luft unter dem Abzug getrocknet und in einem geeignetem Volumen DEPC-behandeltem Wasser aufgenommen. Die Lagerung der RNA fand bei -70 °C statt.

2.2.5.2 Präparation von Poly(A)+-RNA aus Gesamt-RNA

Die meisten eukaryotischen mRNAs tragen am 3’-Ende einen 20-250 Nu langen Poly(A)-Schwanz. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um aus einer Gesamt-RNA-Prä-paration selektiv die mRNA zu isolieren.

Zur mRNA-Isolation wurde der Oligotex-mRNA-Isolationskit von Qiagen verwendet.

Das Produkt enthält in einer als Oligotex-Suspension bezeichneten Mischung kugelige Polystyren-Latex-Partikel mit einheitlichem Durchmesser (1,1 µm), an die dT30-Oligonukleotide kovalent gebunden sind. Übere letztere erfolgt unter Hochsalzbedingungen die Bindung polyadenylierter mRNA an die Latex-Partikel.

Nach Waschschritten zur Entfernung nicht polyadenylierter RNA-Spezies wird die Poly(A)⁺-mRNA durch Erniedrigung der Salzkonzentration von den Oligo-dT-Partikeln freigesetzt.

2.2.5.3 Northern Blot-Analyse

2.2.5.3.1 Auftrennung von RNA in formaldehydhaltigen Agarosegelen

Gesamt-RNA oder Poly(A)⁺-RNA wurde unter denaturierenden Bedingungen in einem Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetrennt. Die denaturierende Wirkung des Formaldehyds war nötig, um Sekundärstrukturen in der einzelsträngigen RNA aufzulösen, die ansonsten eine schlechtere elektrophoretische Auftrennung bewirkt hätten.

Für ein 1,2%iges denaturierendes Agarose/Formaldehyd -Gel wurden 125 ml der fol-genden Gelösung hergestellt: 1,5 g Agarose wurden in 12,5 ml 10 x MOPS-Puffer und 110 ml DEPC-behandeltem Wasser unter Aufkochen gelöst. Nach Abkühlung auf 65 °C erfolgte die Zugabe von 2,25 ml 37%igem Formaldehyd. Die Gellösung wurde auf einen Gelträger gegossen und durch das Einsetzen eines Kammes am oberen Ende beim Festwerden Taschen für die RNA-Proben gebildet. Als Laufpuffer wurden 1,2 l einer Mischung aus 120 ml 10 x MOPS, 24 ml 37%iges Formaldehyd und 1056 ml DEPC-behandeltem Wasser verwendet. Vor dem Auftragen der RNA-Proben wurde zu diesen die entsprechende Menge 5 x RNA-Ladepuffer für Formaldehyd/Agarose-Gele gegeben, der unter anderem zur späteren Visualisierung

der RNA unter UV-Licht Ethidiumbromid enthielt. Um Sekundärstrukturen aufzulösen, wurde die RNA vor dem Auftragen für 5 min bei 65 °C erhitzt. Der Gellauf erfolgte für 4 h bei 80-100 V. Als Richtwert für die Dauer des Gellaufs diente generell die Laufstrecke der Bromphenolblaufront: Sie sollte ca. 2/3 - 3/4 der Gellänge betragen.

Um beim Gellauf entstehende pH-Gradienten zwischen den Elektroden zu kompensieren, wurde der Ladepuffer zweimal zwischen den Elektroden umgepumpt.

Nach dem Gellauf wurde das Gel unter UV-Licht photographiert, die Laufstrecken der 28S-, 18S- und 5S-rRNA no tiert und das Gel für den anschließenden Northern Blot weiterbehandelt.

2.2.5.3.2 Northern Blot

Der Northern Blot ist der Transfer elektrophoretisch aufgetrennter RNAs vom Gel auf eine Membran. Die Membran trägt nach dem Transfer eine Reproduktion des Ban-denmusters auf dem Gel. Das Gel wurde zur Entfernung des Formaldehyds für 5 min bei RT in DEPC-behandeltem Wasser und anschließend für 30 min in 10 x SSC ge-schwenkt. Auf das so vorbehandelte Gel wurde eine angefeuchtete Nylonmembran gelegt (Hybond-N+, Amersham), wobei durch das Auflegen von trockenem, saugfähi-gem Filterpapier auf die Membran durch Kapillarkräfte ein Pufferfluss durch das Gel hin zur Membran erzeugt wurde. Als Transferpuffer wurde 10 x SSC verwendet. Der Transfer erfolgte stets über Nacht. Danach wurde die RNA durch zweistündiges Backen bei 80°C auf der Membran fixiert. Gelagert wurde die Membran trocken, in Folie eingeschweisst und bei 4°C.

2.2.5.3.3 Radioaktive Markierung von DNA-Proben

Die Markierung von DNA-Proben für die Hybridisierung erfolgte unter Verwendung des random prime labelling-Kit von Gibco-BRL nach Angaben des Herstellers. Bei Vorliegen spezifischer Primer war eine radioaktive Markierung durch PCR möglich.

Bei Verwendung von α³²P-dCTP (10 µCi = 1 µl) betrug der Anteil des nichtradioaktiven dCTP im dNTP-Mix 1/10 dessen von dATP, dGTP und dTTP. Bei Verwendung von Oligonukleotiden als Sonden wurden diese durch 5‘-Endmarkierung

mit Hilfe der T4-Polynukleotidkinase radioaktiv markiert (siehe Abschnitt 2.2.4.1.2,

„Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten“).

2.2.5.3.4 Reinigung radioaktiv markierter DNA-Proben

Die Reinigung der DNA-Proben zur Abtrennung nicht eingebauter Nukleotide nach der Markierung erfolgte durch eine Ethanolfällung mit ½ Volumen 7,5 M Ammoniumacetat (bei Oligonukleotiden 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2), 1/20 Volumen Glykogen (20 mg/ml) als Carrier-Substanz und dem dreifachen (Oligos: achtfachen) Volumen Ethanol. Das Präzipitat wurde mit 85%igem Ethanol gewaschen und in 100 µl TE-Puffer für 15 min bei 65°C gelöst. Vor Zugabe zur Membran wurde die DNA für 5 min bei 100°C denaturiert.

2.2.5.3.5 Hybridisierung von RNA auf Northern Transfermembranen mit radioaktiv markierten DNA-Proben

Um spezifische RNA-Sequenzen, die auf eine Membran übertragen waren, nachzuweisen, wurde diese mit einer zur nachzuweisenden Sequenz komplementären, radioaktiv markierten DNA-Probe hybridisiert. Unspezifische Bindungen wurden durch mehrmalige Waschschritte danach gelöst.

Nach Fixierung der RNA auf der Membran wurde diese für mindestens 4 Stunden bei 42°C in Hybridisierungslösung (1ml/10cm² Membran) und 100 µg denaturierter Fisch-Sperma-DNA inkubiert. Zu der Hybridisierungslösung (bei Verwendung von Oligo-Sonden enthielt die Hybridisierungslösung kein Formamid) wurde dann die radioaktiv markierte DNA-Probe nach vorheriger Denaturierung zugegeben. Die Hybridisierungsreaktion erfolgte bei 42°C über Nacht. Im Anschluss daran wurde die Membran mit zunehmender Stringenz (abnehmende SSC-Konzentration und zunehmende Temperatur) gewaschen:

2 x15 Minuten bei 45°C mit 2 × SSC / 0.1% SDS 2 x 15 Minuten bei 45°C mit 1 × SSC / 0.1% SDS 2 x 15 Minuten bei 45°C mit 0,5 × SSC / 0.1% SDS 2 x30 Minuten bei 60°C mit 0,1 × SSC / 0.1% SDS

Anschließend wurde die Membran in Plastikfolie eingeschweisst und auf einem Röntgenfilm oder einem Phosphorimager-Screen exponiert.