2 Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.10 RNA-Isolierung
Tabelle 14: Für die RNA-Isolierung verwendete Kits und Lösungen
Materialien Hersteller
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden
Ethanol, absolut J.T. Baker, Phillipsburg, USA DEPC behandeltes Wasser, Nuklease-frei Ambion, Austin, USA
RNase free DNase Set Qiagen, Hilden
cDNA-Synthese
Tabelle 15: Für die cDNA-Synthese verwendete Kits und Materialien
Materialien Hersteller
Omniscript Kit Qiagen, Hilden
Oligo-dT-Primer Roche Diagnostics, Mannheim
Random-Hexamer-Primer Roche Diagnostics, Mannheim RNase Inhibitor (40 U/µL) Roche Diagnostics, Mannheim
2.1.11 Konventionelle PCR
Tabelle 16: Für die konventionelle PCR eingesetzte Enzyme, Puffer, Oligonukleotide und weitere Materialien
Materialien Hersteller Cloned Pfu DNA-Polymerase (2,5 U/μl) Stratagene, Amsterdam, NL
10x Cloned Pfu DNA-Polymerase Puffer Stratagene, Amsterdam, NL Taq-Polymerase (5 U/μl) Roche Diagnostics, Mannheim 10x Taq- Polymerase Puffer Roche Diagnostics, Mannheim
dNTP (10 mM) Roche Diagnostics, Mannheim
Primer forward/reverse Metabion, Martinsried
PCR grade water Sigma, Deisenhofen
2.1.12 Real-Time-PCR
Tabelle 17: Für die quantitative Real-Time-PCR benötigte Kits, Primer und Sonden
Materialien Hersteller LightCycler®Fast-Start DNA Master
HybProbe-Kit
Roche Diagnostics, Mannheim
Primer forward/reverse Metabion, Martinsried Sonde FL/LC
FL= Fluorescein LC= LCRed640
Metabion, Martinsried
2.1.13 DNA- und RNA-Elektrophorese
Tabelle 18: Für die Gelelektrophorese benötigte Substanzen und Lösungen
Materialien Hersteller
TBE (10x) Gibco BRL, Karlsruhe
MESA (10x) Sigma, Deisenhofen
Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen
Ethidiumbromid (10 mg/ml H2O) Sigma, Deisenhofen DNA-Größenmarker 100 bp MBI Fermentas, St.Leon-Rot SeaKem LE Agarose Biozym, Hess. Oldendorf
2.1.14 Fragmentisolierung aus PCR-Ansätzen, bzw. aus Agarosegel
Zur Isolierung spezifischer PCR-Produkte aus dem Reaktionsansatz wurde das QIAquick-Purification-Kit von Qiagen, Hilden benutzt. Für die Isolierung von PCR-Produkten aus Agarosegel wurde das QIAEX II Agarose-Gel-Extraction-Kit von Qiagen, Hilden eingesetzt.
2.1.15 Polyacrylamidelektrophorese
Bei der Proteinauftrennung für Western-Blot wurde das 10 % Precise Protein Fertiggel, von Pierce, Rockford, USA benutzt.
2.1.16 Proteinmessung
Zur Proteinkonzentrationsmessung wurde das BSA Standard-Kit von Pierce, Rockford, USA eingesetzt.
2.1.17 Western-Blot
Tabelle 19: Für den Western-Blot eingesetzte Substanzen, Lösungen und Antikörper
Materialien Hersteller
MPER (Mammalian Protein Extraction Reagent) Pierce, Rockford, USA Ladepuffer:
Non-reducing lane marker sample buffer 2-Mercaptoethanol
Pierce, Rockford, USA Merck-Schuchardt, Hohenbrunn
Page Ruler Prestained Protein Marker MBI Fermentas, St.Leon-Rot
Laufpuffer x10:
238 g HEPES 121 g Tris 10 g SDS
Gibco BRL, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Wet-Blotpuffer x10:
1,9 M Glycin 1 M Tris 10 % SDS 20 % Methanol
Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe
J.T. Baker, Deventer, NL Blockierungspuffer PBST:
1x PBS Tween 0,1 1 % BSA
Biochrom, Berlin Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Antikörper:
1.Antikörper:
Anti-PAX2:
Rabbit anti-phospho-PAX2 (Ser 393) Anti-WT1:
Rabbit anti-WT1
Invitrogen, Carlsbad, USA Sigma, Deisenhofen
Fortsetzung Tabelle 19
Materialien Hersteller Anti-Aktin:
Anti-Aktin from rabbit (A 2066) Anti-GAPDH:
Mouse anti-GAPDH 2.Antikörper:
ECL, Anti-rabbit IgG, PE-linked from donkey NA 934 Anti-mouse IgG-HRP
Sigma, Deisenhofen Biodesign, Saco, USA
Amersham Pharmacia, Hannover
R&D Systems, Minneapolis, USA
ECL-Reagens Amersham Pharmacia,
Hannover
2.1.18 Transfektion
Tabelle 20: Für die Transfektion verwendete Kits, Oligonukleotide und Lösungen
Materialien Hersteller BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression
Vector-Kit
Invitrogen, Carlsbad, USA ssOligonukleotide für pre-miRNA-Synthese MWG Biotech AG, Ebersberg Hp GenomeWide siRNA 1027400 Qiagen, Hilden
Suspensios-Puffer Qiagen, Hilden
RNAiFect-Kit Qiagen, Hilden
Nucleofector-Solution Amaxa, Gaithersburg, USA
2.1.19 Verwendete Geräte
Tabelle 21: Für die Durchführung der Versuche verwendete Geräte
Materialien Hersteller Biological Safety Cabinett ClassII Typ A/B3 Nuaire, Plymouth, USA
Blotkammer BioRad, München
Brutschrank Automatic CO2 Inkubator Friedrich S. Bartolomey, Alfter Brutschrank CO2-Auto-Zero Kendro Laboratory Products, Berlin Durchflusszytometer FACScan Bioscience, Becton Dickinson, Heidelberg
Entwickler Western-Blot BioRad, München
Gelkammer für Agarosegele Horizon 58 Gibco BRL, Karlsruhe Gelkammer Mini PROTEAN 3 Cell BioRad, München
Inkubator Orbital Incubator SI50 Dunn Labortechnik, Asbach Kühlgeräte -4°C, -20°C Liebherr, Ochsenhausen
Kühlgeräte -80°C Forma Scientific, Marietta, USA Laborwaage KB 800-2 Kern&Sohn, Balingen
Mikroskop Zeiss, Jena
Mikrowellenherd Moulinex, Paris
ND 1000 Spectrophotometer Nano Drop Technologies, Wilmington, USA Nucleofector-Elektroporationsgerät Amaxa, Gaithersburg, USA
Olympus Digitalkamera Olympus, Hamburg
PCR-Gerät Light Cycler® Real-Time Roche Diagnostics, Mannheim
PCR-Gerät Gradienten Cycler Biorad, München
PCR-Gerät Multi Cycler PTC-200 MJ Research, Biozym, Hess. Oldendorf Sterile Werkbank PCR Captair®bio Erlab, Köln
Thermoblock TB1 Biometra, Göttingen
Thermomixer Eppendorf 5436 Eppendorf, Hamburg Tischzentrifuge Eppendorf 5415C Eppendorf, Hamburg UV-Schirm Reprostar II LAMAG, Berlin
Vortexer VF2 IKA- Labortechnik, Staufen
Zentrifuge Eppendorf 5804R Eppendorf, Hamburg Zentrifuge Varifuge 3.2RS Heraeus Sepatech, Osterode
2.1.20 Hilfsmaterialien
Tabelle 22: Eingesetzte Hilfsmaterialien
Materialien Hersteller
Einfrierboxen Nunc, Roskilde, DK
Einfrierröhrchen Nunc, Roskilde, DK
Elektroporationsküvetten Amaxa, Gaithersburg, USA
Falcontubes (15 ml und 50 ml) Falcon, Becton Dickenson, Heidelberg Filterpapier 3MM Schleicher und Schüll, Dassel
Glasgefäße diverse Schott Duran, Mainz Neubauer Zählkammer Sigma, Deisenhofen
Nitrocellulosemembran Hybond N Amersham Pharmacia, Hannover
Petrischalen Roth, Karlsruhe
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Brand, Wertheim
Pipetten, serologische Sarstedt, Nümbrecht
Reaktionsgefäße Biozym, Hess. Oldendorf
Sterilfilter NeoLab, Heidelberg
12-well Mikrotiter-Platte Nunc, Roskilde, DK 24-well Mikrotiter-Platte Nunc, Roskilde, DK 96-well Mikrotiter-Platte Corning, New York, USA Zellkulturflaschen NUNCLON™ 160 ml Nunc, Roskilde, DK
Zellschaber VWR, Darmstadt
2.1.21 Verwendete Software
Tabelle 23: Für die Messungen und Auswertungen benutzte Software
Software Hersteller
dChip 2006 (Cluster-Analyse) Cheng Li Group, Harvard School of Public Health, Boston, USA
EndNote (Literaturverwaltung) Thomson-Reuters, Carlsbad, USA
FACScan, Cell-Quest Software Bioscience, Becton Dickinson, Heidelberg Microsoft Excel Microsoft, Redmond, USA
Fortsetzung Tabelle 23
Software Hersteller Microsoft Power Point Microsoft, Redmond, USA
Microsoft Word Microsoft, Redmond, USA
Nano Drop Software ND-1000 V3.1.0 Nano Drop Technologies, Wilmington, USA Light Cycler® Probe Design Software
Version 1.0 Roche Diagnostics, Mannheim
PCR RT-Light Cycler® Software
Version 3.39 Roche Diagnostics, Mannheim
RNAi Designer Invitrogen, Carlsbad, USA SPSS 15.0 (Statistik) SPSS, Chicago, USA