Der letzte Prozess im Lebenszyklus von RNA ist deren Abbau. Auch daran sind RNA Helika-sen beteiligt. Der Abbau von RNA stellt einen wichtigen Prozess dar, da die Konzentration von bestimmten Proteinen, z.B. Zellzyklus regulierenden Faktoren, genau reguliert werden muss. Werden RNAs von solchen Genen nicht zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebaut, kann dies zu gravierenden Zellzyklusstörungen und eventuell zum Zelltod führen. Außerdem kön-nen falsche RNAs, also solche mit nicht gespliceten Introns, oder interkön-nen Stopcodons die
(LQOHLWXQJ
bosomen unnötig blockieren. Daher ist es notwendig, solche RNAs möglichst schnell zu ent-fernen.
Den Prozess des RNA Abbaus kann man in zwei Bereiche unterteilen. Den einen Bereich stellt der „normale“ Abbau von mRNA nach der Translation dar, den anderen die programmierte Zerstörung von RNAs, die „nonsense Codons“ enthalten - der sogenannte „Nonsense mediated Decay“ (NMD).
Beim ersteren beginnt der Abbau der mRNA prinzipiell mit der Entfernung des 3’ poly(A) Be-reiches. Dies ist der initiale Schritt sowohl in Hefe, als auch in höheren Eukaryonten. Den meisten Einblick in diesen Mechanismus haben Studien in 6FHUHYLVLDH erbracht. In der Hefe wurden zwei unterschiedliche Deadenylierungsmechanismen identifiziert. Der eine wird durch Pan2/Pan3-Komplex repräsentiert, der vom poly(A)-bindenden Protein (Pab)1 abhängt. Von diesem Komplex nimmt man an, dass er nasciernde poly(A) Bereiche im Kern trimmt, bevor die mRNA exportiert wird. Er ist aber wahrscheinlich auch an der Deadenylierung im Zytop-lasma beteiligt (BoeckHWDO, 1996; Brown und Sachs, 1998; TuckerHWDO, 2001).
Der zweite Deadenylierungsmechanismus besteht aus den zwei Transkriptionsregulatoren Ccr4 und Caf1. Der Ccr4/Caf1 Komplex stellt LQYLYR und LQYLWUR den vorrangigen Deadeny-lierungskomplex dar. Allerdings muss man beide Komplexe, sowohl den Pan2/Pan3, als auch den Ccr4/Caf1 Komplex disruptieren, um einen Effekt auf die Deadenylierung LQYLYR zu sehen (TuckerHWDO, 2001).
Die Deadenylierung induziert eine relativ schnelle Abspaltung der 5’ Cap-Struktur durch das decapping Enzym Dcp1p (BeelmanHWDO, 1996; LaGrandeur und Parker, 1998). Fischer und Weis (2002) konnten zeigen, dass Dhh1p die decapping-Aktivität von Dcp1p LQYLWUR stimu-liert. Durch biochemische und genetische Studien wurden mittlerweile mehrere Faktoren iden-tifiziert, die am Decapping beteiligt sind, wie z.B. Dcp2 (Dunckley und Parker, 1999), Vps16 (ZhangHWDO, 1999), Pat1 (BonnerotHWDO, 2000; HatfieldHWDO, 1996) und die Lsm Proteine (BouveretHWDO, 2000; TharunHWDO, 2000). Nach der Entfernung der Cap-Struktur wird der verbleibende mRNA Rest durch die 5’ Exonuklease Xrn1p abgebaut (Hsu und Stevens, 1993).
In der Hefe sind auch 3’ Exonukleaseaktivitäten vorhanden, die aber bei dem normalen mRNA Abbau eher eine untergeordnete Rolle spielen (JacobsHWDO, 1998).
Nachdem die mRNA Synthese einen Multistep-Prozess darstellt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass un- oder fehlgesplicete RNAs, RNAs mit unnatürlich langen 3’-untranslatierten Regionen oder RNAs mit falschen oder fehlenden Stopcodons entstehen. Diese sogenannten
„nonsense“ RNAs werden durch den NMD abgebaut. Neueste Studien haben gezeigt, dass
auch innerhalb des NMD Unterschiede in der Art des Substarts gemacht werden. Kürzlich wurde gezeigt, dass eukaryontische RNAs ohne Stopcodon, sogenannte „nonstop“ RNAs sehr schnell abgebaut werden (FrischmeyerHWDO, 2002).
In der Hefe sind drei WUDQV-agierende Faktoren für den NMD essentiell, Upf1p, Upf2p und Upf3p (LeedsHWDO, 1991). Upf1p gehört zur Superfamilie 1 der RNA Helikasen und ist von der Hefe bis zum Menschen konserviert. Das Upf1 Protein zeigt nukleinsäureabhängige ATPa-se Aktivität und besitzt eine 5’-3’ HelikaATPa-se Aktivität sowohl auf DNA wie RNA Substraten.
Interessanterweise wird „nonstop“ RNA in XSI∆-Stämmen nicht stabilisiert, was eine Unter-scheidung zwischen dem Abbau von RNA, die kein Terminations-Codon enthält und dem NMD zeigt (FrischmeyerHWDO, 2002). Wie oben beschrieben, benötigt der normale Abbau von RNA eine Deadenylierung gefolgt von einer Dcp1p-vermittelten Entfernung der 5’ Cap-Struktur und dem 5’-3’ Abbau durch Xrn1p. mRNA im NMD wird ohne vorherige Deadeny-lierung abgebaut (Muhlrad und Parker, 1994). Nonstop Transkripte hingegen werden aber so-wohl in [UQ∆, GFS und FFU∆ Stämmen abgebaut. Daraus lässt sich ableiten, dass nonstop RNA weder durch den NMD noch durch den normalen Abbau von mRNA beseitigt wird.
Neue Studien haben gezeigt, dass nonstop RNA vom Exosom-Komplex in 3’-5’ Richtung ab-gebaut wird (van HoofHWDO, 2002). Der Exosom-Komplex besteht aus den Proteinen Ski3p, Ski8p und der putativen RNA Helikase Ski2p (JacobsHWDO, 1998). Ski2p stellt auch das zy-toplasmatische Homologe von Dob1p dar (siehe oben). Somit kann man ähnliche Mechanis-men bei der Rekrutierung und Funktion von Ski2p und Dob1p/Mrt4p bei der Unterstützung des Exosom-Komplexes annehmen. Es ist anzunehmen, dass die oben erwähnte Akkumulation von poly(A)+ RNA im Zellkern in GRE-Stämmen eher eine Konsequenz der Effekte auf den kernbasierten RNA Turnover als den RNA Export ist (Abb. 1-10).
(LQOHLWXQJ
$EE Kompartimentalisierung der RNA Helikasen Dob1p und Ski2p, die bei der 3’-5’ exonukleolytischen Aktivität des Exosom-Komplexes im Kern bzw. Zytoplasma mitwirken.
Beim Fehlen von Dob1p oder Ski2p akkumulie-ren die RNA Substrate, da der Exosom-Komplex durch die Sekundärstrukturen blockiert wird (nach de la CruzHWDO, 1999).
Aus dieser kurzen Einführung in den Aufbau, die Funktion und die Beteiligung von RNA He-likasen kann man erkennen, dass RNA HeHe-likasen eine Gruppe von Proteinen darstellen, die eine hohe biologisch Wichtigkeit besitzen. RNA Helikasen sind an vielen unterschiedlichen Prozessen beteiligt, weshalb das Fehlen einer oder mehrerer dieser Proteine weitläufige Aus-wirkungen auf die Funktionen innerhalb der Zelle haben kann. Daher stellen diese Proteine, ein hochinteressantes Forschungsgebiet dar, das gerade in jüngerer Zeit immer mehr an Bedeu-tung gewinnt.
$XIJDEHQVWHOOXQJ
In der vorliegenden Arbeit sollte zunächst eine mögliche Beteiligung des Dhh1 Proteins aus 6DFFKDURP\FHVFHUHYLVLDH an DNA Reparatur Vorgängen untersucht werden. Dazu sollten die Auswirkungen einer Deletion von '++ in den Hefestämmen W303-1A und CenPK2 auf die Sensitivitäten gegenüber Bleomycin, MMS, UV-Strahlung und γ-Strahlung untersucht werden.
Außerdem sollte die Auswirkung einer '++ Deletion auf die Effizienz und Genauigkeit des Non-homologous End-joining Reparaturwegs untersucht werden.
Im zweiten Teil der Arbeit sollten funktionelle Domänen des Dhh1 Proteins LQYLYR charakteri-siert werden. Dazu sollten N- und C-terminale Verkürzungsmutanten hergestellt werden sowie Mutationen in das ATPase Motiv und in das sogenannte SAT-Motiv eingeführt werden um deren Wichtigkeit für die LQYLYR Funktion des Dhh1 Proteins zu prüfen. Die Funktionalität der verschiedenen Dhh1 Mutanten sollte mit einem geeigneten Testsystem qualitativ untersucht werden.
0DWHULDO
0 $7(5,$/
%DNWHULHQVWlPPH
Alle verwendeten Bakterienstämme wurden aus der Stammsammlung der Abteilung Prof.
E.-L. Winnacker entnommen.
Stamm Genotyp Referenz
E.coli sure E14-(PFUA), ∆(PFUCB-KVGSMR-mrr)117, VEFC, UHFB, UHFJ, XQXC::Tn5(kanr), VXSE44, J\UA96, UHOA1, ODF, WKL-1, HQGA1, XYUC[F’SURAB, OD FIqZ∆M15, Tn10(Tetr)]
Greener, 1990;
Doherty HWDO., 1993
E.coli TOP10F’ F’{lacIqTetR}, PFUA, ∆(PUU-KVGRMS-PFUBC), φ80ODFZ∆M15, ∆ODFX74, GHRR, UHFA1, D UDD139, ∆(DUD-OHX)7697, JDOU, JDOK,USVL, HQ GA1, QXSG
Invitrogen BV Niederlande
E.coli XL1Blue UHFA1, HQGA1, J\UA96, WKL-1, KVGR17(rK-,mK+), VXSE44, UHOA1, ODF, [F’WUDD36, SURAB,
lacqZ∆M15, Tn10(tetr)]
Bullock HWDO, 1987
+HIHVWlPPH
Stamm Genotyp Referenz Quelle
W303-1A Mat a, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
Thomas und Rothstein, 1989
Prof.
Bandlow, München W303-1B Mat α, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11,
WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
Thomas und Rothstein, 1989
Prof.
Bandlow, München W303 aL Mat a, \NX/(8, DGH2-1,
XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX 2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
Feldmann und Winnacker, 1993
Arbeitskreis
W303 αL Mat a, \NX/(8, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX 2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
Feldmann und Winnacker, 1993
Arbeitskreis
W303 aU Mat a, \NX85$, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX 2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
Feldmann und Winnacker, 1993
Arbeitskreis
W303 ah2 Mat a, \NX.DQ0;, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX 2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
Feldmann HWDO, 1996
Arbeitskreis
W303 aLh2 Mat a, \NX/(8,
\NX.DQ0;, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ 1-100, UDG5-535
Feldmann HWDO, 1996
Arbeitskreis
W303 aα Mat a, Mat α, DGH2-1, XUD3-1, KLV 3-11, WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
Arbeitskreis
W303 aUαL W303 aU x W303 αL Driller HWDO, 1999
Arbeitskreis W303 a∆DH Mat a, '+++,6, DGH2-1, XUD
3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
diese Arbeit Arbeitskreis
W303 a∆DK Mat a, GKK.DQ0;, DGH2-1, XUD 3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
diese Arbeit Arbeitskreis
W303 α∆DH Mat α, GKK+,6, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ 1-100, UDG5-535
diese Arbeit Arbeitskreis
W303 aL∆DH Mat a, \NX/(8, GKK+,6, DGH2-1, XUD3-1, KLV3-11, WUS1-1, OHX2-3,2-112, FDQ1-100, UDG5-535
diese Arbeit Arbeitskreis
IL993-5C Mat α, LOY5 Wolf HWDO.,
1973
Prof.
K. Wolf, Mainz
KL114-4A Mat a, KLV1, WUS2 Wolf HWDO.,
1973
Prof.
K. Wolf, Mainz CenPK2a Mat a, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS
1-289, KLV3-∆1, 0$/F, 0$/, 68&, *$/
Prof. K.-D.
Entian, Frankfurt/M
Prof. H.
Domdey, München CenPK2α Mat α, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS
1-289, KLV3-∆1, 0$/F, 0$/, 68&, *$/
Prof. K.-D.
Entian, Frankfurt/M
Arbeitskreis
CenPK2aL Mat a, \NX/(8, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS1-289, KLV3-∆1, 0$/
F, 0$/, 68&, *$/
Arbeitskreis
CenPK2αL Mat α, \NX/(8, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS1-289, KLV3-∆1, 0$/
F, 0$/, 68&, *$/
Arbeitskreis
0DWHULDO
CenPK2aU Mat a, \NX85$, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS1-289, KLV3-∆1, 0$/
F, 0$/, 68&, *$/
Arbeitskreis
CenPK2ah2 Mat a, \NX.DQ0;, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS1-289, KLV3-∆1, 0$/
F, 0$/, 68&, *$/
Arbeitskreis
CenPK2aα Mat a, Mat α, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS1-289, KLV3-∆1, 0$/F, 0$/, 68&, *$/
Prof. K.-D.
Entian, Frankfurt/M
Prof. H.
Domdey, München CenPK2aUαL CenPK2aU x CenPK2αL Driller HWDO,
1999
Arbeitskreis CenPK2ah2αh2 CenPK2ah2 x CenPK2αh2 Driller HWDO,
1999
Arbeitskreis CenPK2a∆DH Mat a, GKK+,6, OHX2-3,112,
XUD3-52, WUS1-289, KLV3-∆1, 0$/
F, 0$/, 68&, *$/
diese Arbeit Arbeitskreis
CenPK2α∆DH Mat α, GKK+,6, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS1-289, KLV3-∆1, 0$/
F, 0$/, 68&, *$/
diese Arbeit Arbeitskreis
CenPK2a DHH1 C-myc
Mat a, OHX2-3,112, XUD3-52, WUS 1-289, KLV3-∆1, 0$/F, 0$/, 68&, *$/, '++&P\F+,60;
diese Arbeit Prof. H.
Domdey, München
3ODVPLGH
Beschreibungen und Ursprung der verwendeten Plasmide sind in nachfolgender Tabelle ange-geben.
Plasmidbezeichnung Genbank Accession Number
Referenz Quelle
pGEM-4Z X65305 Promega Cooperation
Technical Service
Arbeitskreis
pBluescript II KS(+) X52327 Alting-Mees und Short, 1989
Prof. Lipp, Berlin
pZeroTM-2 kein Eintrag Invitrogen Cooperati-on, 1995
Arbeitskreis
pRS313, pRS314, pRS315, pRS316
U03440 U03442
Sikorski und Hieter, 1989
Prof Bandlow, Mün-chen
pAU, pAH, pAT, pAL
kein Eintrag Mai, Bernd, München
(Q]\PH
Amersham/Pharmacia Thermosequenase-Kit DuPont Glusulase MBI Fermentas 7DT DNA-Polymerase
Restriktionsenzyme
New England Biolabs Klenow-Fragment DNA-Polymerase l ((FROL) Restriktionsenzyme
Roche Diagnostics GmbH 3ZR DNA-Polymerase Lysozym
RNase A
Shrimps Alkalische Phosphstase (SAP) Sigma Chemie München
Biomol Feinchemikalien GmbH, Hamburg
Lytikase Zymolyase
&KHPLNDOLHQ
Acrylamid:Bisacrylamid (19:1) 20 % Biozym Accugel Acrylamid:Bisacrylamid (30:0,8) 30 % Biozym Accugel
Agarose „LE“ SeaKem
Ammoniumacetat (NH4OAc) Merck
Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck
Ampicillin Sigma
Bacto Agar Difco
Bacto Trypton Difco
Bacto Peptone Difco
Bacto Hefe Extrakt Difco
Bromphenolblau Sigma
Chloroform Riedel de Haen
Dinatrium-hydrogenphosphat, p. a. (Na2HPO4) Merck
Essigsäure Roth
Ethanol >99,8 %, p.a. Roth
0DWHULDO
Ethanol 99 %, vergällt mit 1 % MEG. Graen
Ethidiumbromid (100 mg/ml) Roth
Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA, TitriplexIIl) Merck
Glycerin p.a. Roth
Glycin >99,7 %, p.a. Roth
Harnstoff, p.a. Roth
Isopropanol >99,7 %, p.a. Roth
Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck
Natriumacetat (NaOAc) Merck
Natriumchlorid (NaCl) Merck
Natrium-dihydrogenphosphat, p. a (NaH2PO4) Merck
Natriumdodecylsulfat (SDS) ICN Biomedicals GmbH
Natriumhydroxid-Plätzchen Roth Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) Roth
Polyethylenglycol 8000 (PEG 8000) Roth Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20) Sigma
Salzsäure (HCl) 37 % Roth
TEMED Serva Trishydroxymethylaminomethan (Tris) Merck
Wasser (Reinstwasser), ultrafiltriert Millipore Reinstwasseranlage
2OLJRQXNOHRWLGH
Die in dieser Arbeit verwendeten synthetischen Oligonukleotide wurden bei den Firmen Meta-bion und MWG-Biotech bestellt.
*HUlWH
Filmentwicklermaschine Amersham, Hyperprocessor
Gelelekrophorese-Apparaturen:
horizontal
Sequenzgele (vertikal)
BioRad; Harnischmacher BioRad
Hybridisierungsofen Bachofer PCR Thermocycler Biometra (Biometra Trio Thermoblock)
Phosphor-Imager Molecular Dynamics, Storm 860
Phosphor-Screen Kodak Storage Phosphor Screen
Schüttelinkubatoren Ikamag IKA-Vibrax-VXR,
Spannungsgeräte Consort E321, 433, 734
Thermomixer Eppendorf-Thermomixer 5436
Tischzentrifuge Eppendorf-Zentrifuge 5417
Ultraschall-Gerät Branson Sonifier 250
UV-Crosslinker Spectrolinker XL-1500 UV, Spectronics Cor-poration
UV-Illuminatoren, 245 und 366 nm Bachofer
Vakuum-Konzentrator („speed-vac“) Bachofer
Vakuumofen Heraeus
Vortex Vortex-Genie, Scientific Industries
Zentrifugen Sorvall RMC 14, Rotor: Sorvall FA-Micro
Centrifuge 5417, Eppendorf GS-15 R, Beckmann
RC 26 Plus, Sorvall
9HUEUDXFKVPDWHULDOLHQ
Blotting-Papiere Schleicher & Schuell, GB 001 und GB 004
Kunststoffolie Saran Wrap, Dow
Membranfilter, 0,2 µm Schleicher & Schuell NL 17
Nylonmembranen Hybond N+, Amersham
Parafilm American National Can
Pipettenspitzen Eppendorf Crystal, Gilson
Reaktionsgefäße 2ml, 1,5 ml, 0,5 ml Eppendorf Safe-Lock
Röntgenfilme Kodak X-omat
Spritzenaufsatzfilter, 0,22 µm Millipore Millex-GP
0HWKRGHQ