Retargeting

DISKUSSION

ermöglicht, eingeschlossen solche Gewebe, die normalerweise aufgrund des Fehlens des Coxsackie- und Adenovirusrezeptors oder anderer adäquater primärer Rezeptoren nicht empfänglich für Ad-Infektionen sind (Einfeld et al., 2001).

Für die Umsetzung des adenoviralen Retargeting existieren im Wesentlichen zwei unterschiedliche Strategien, das genetische sowie das nicht-genetische Retargeting. Beide zielen darauf ab, den natürlichen Tropismus der Adeno-viren zu modifizieren, um ausschließlich bestimmte Zielzellen oder -gewebe spezifisch und effizient zu infizieren.

Strategien des genetischen Retargeting beinhalten die Konstruktion chimärer Fiberproteine (Krasnykh et al., 1996) bzw. Modifikationen im Sinne des Ein-bringens von Erkennungssequenzen zellulärer Rezeptoren in Pentonbasis (Wickham et al., 1995), Hexon (Vigne et al., 1999) oder Fiberknopf (Krasnykh et al., 1997, 2001; Dmitriev et al., 1998; Kirby et al., 1999; Wesseling et al., 2001;

Martin et al., 2003; Nagel et al., 2003). Besondere Bedeutung hat diesbezüg-lich insbesondere die an αvβ3- und αvβ5-Integrine bindenden RGD-Sequenz, wobei aber auch alternative Peptidliganden in Frage kommen. Ein chimäres Pentonbasis-Protein, in dem das RGD-Motiv durch das Triplet LDV ersetzt wurde, zeigte sich in der Lage, an das Integrin α4β₁ zu binden, welches in großem Umfang auf Lymphozyten und Monozyten exprimiert wird (Wickham et al., 1995).

Die Entwicklung von Adenovirus-Vektoren, in denen die Fiber oder die Penton-basis entsprechend den speziellen Rezeptoren und Integrinen der Zielzelle ver-ändert bzw. angepasst sind, z. B. passende Integrin-Erkennungsstellen tragen, könnte so einen effizienteren, gewebsspezifischen Gen-Transfer ermöglichen (Wickham et al., 1996; 1997; Koizumi et al., 2003). Ad 5-basierte Vektoren, in deren Fiberknopf eine RGD-Domäne eingefügt wurde, zeigten in verschiede-nen Zell- und Gewebetypen eine deutlich höhere Transduktionseffizienz als solche, denen dieses Triplet fehlte (Biermann et al., 2001; Gao et al., 2004).

In diesem Zusammenhang bemerkenswert ist, daß das die RGD-Sequenz erkennende Integrin αvβ₃ von den Endothelzellen der Blutgefäße in großem

Umfang, und auch in verschiedenen neoplastischen Geweben in erhöhtem Maß exprimiert wird (Max et al., 1997; McDonald et al., 1999; Bauerschmitz et al., 2004). Auf diese Weise könnte die Angiogenese, die eine Schlüsselrolle z. B. bei der Wundheilung, aber auch beim Wachstum und der Metastasierung maligner Tumoren spielt, der selektiven Gentherapie zugänglich gemacht werden. Zu diesem Zweck wurden bereits auf retroviralen Hüllproteinen basierende liposomale Vektoren, sogenannte AVP (artificial virus-like particles), entwickelt, die mit einer das Tripeptid RGD enthaltenden Polypeptidsequenz versehen wurden, welche als Ligand für die auf den Endothelzellen der Tumor-gefäße verstärkt exprimierten αvβ3-Integrine diente (Muller et al., 2001;

Nahde et al., 2001).

Auch mit adenoviralen Vektoren mit RGD-modifizierten Fibern, die einen Apoptose-induzierenden Liganden enthalten, konnten bereits in vivo Regres-sionen im Wachstum von Pankreas- und Darmtumoren erzielt werden (Jacob et al., 2004).

Auf ähnliche Weise konnte mit an Zytostatika gekoppelten Phagenpeptiden, welche die RGD-Sequenz enthielten, die Effizienz des Chemotherapeutikums gegen humane Brustkrebs-Xenografte in Mäusen gesteigert, und durch die selektive Bindung gleichzeitig seine Toxizität reduziert werden (Arap et al., 1998). Auch andere nicht-virale Gentransportersysteme, bestehend aus Protein-Plasmid-DNA-Komplexen, erzielten bereits unter Verwendung von RGD-Tripeptiden eine erfolgreiche Genexpression in Tumorzellen (Hosseinkhani und Tabata, 2004). Ein alternativer Weg wurde mit der Einführung der gesamten Pentonbasis-Sequenz oder ihrer zentralen Region in Lambda-Phagen beschritten, auch diese chimären Vektoren erwiesen sich als effizient in der Transduktion von Säugetierzellen (Piersanti et al., 2004).

Einen weiteren Ansatzpunkt der Gentherapie stellen die dendritischen Zellen

DISKUSSION

Antigenmaterial in diese Zellen könnte eine Art von Anti-Tumor-Immunität induzieren. Dendritische Zellen exprimieren allerdings nur geringe Mengen des Coxsackie- und Adenovirusrezeptors, eine ausreichende Expression von αv-Integrinen konnte jedoch nachgewiesen werden. Durch den Einsatz Ad-basierter Vektoren mit Insertion eines RGD-Tripeptids in den H I-Loop des Fiberknopfes konnten so bereits dendritische Zellen in vitro effizient transduziert werden (Asada-Mikami et al., 2001; Okada et al., 2001). Darüber hinaus gelang es bereits, durch derart modifizierte Vektoren, die ein Ober-flächenantigen eines malignen Tumors kodierten, in Mäusen eine signifikant erhöhte zelluläre Immunität gegen dieses Antigen zu erzeugen, resultierend in regredientem Tumorwachstum (Worgall et al., 2003).

Auch zur Verhinderung der Re-Stenosierung von Venenimplantaten nach koronaren Bypass-Operationen könnte die Gentherapie mit rekombinanten adenoviralen Vektoren ein vielversprechendes Werkzeug sein (Raman et al., 2004). Limitiert wird dieser experimentelle Ansatz erneut vor allem durch die niedrige Transduktionseffizienz der Muskel- und Endothelzellen der Blut-gefäße, zurückzuführen auf die geringe Expression des Coxsackie- und Adenovirusrezeptors in diesen Zellen. Auch auf diesem Anwendungsgebiet konnte durch Vektoren mit eingefügter RGD-Sequenz im H I-Loop des Fiber-knopfes bereits ein erhöhter Gentransfer bzw. eine verstärkte Genexpression erzielt werden (Hay et al., 2001).

Viele dieser Strategien des genetischen Retargeting lassen jedoch native Bindungsstrukturen des Virions unverändert und erweitern somit lediglich den viralen Tropismus, statt ihn gezielt einzugrenzen. Damit diese Vektoren effektiv in vivo funktionieren, sind gewebespezifische Promotoren oder andere regulatorische Elemente notwendig, die native Zellbindungen unterdrücken.

Dennoch werden trotz des erhaltenen Tropismus die virale Dissemination und somit auch die Toxizität reduziert, weil aufgrund der erhöhten Spezifität die Applikation geringerer Vektordosen möglich ist (Vigne et al., 1999).

Ein vollständiges genetisches Retargeting mit grundlegend verändertem Tropismus konnte unlängst erzielt werden, indem Wirtzell-bindende Liganden

des Ad-Fiberknopfes deletiert, und simultan mit dem Integrin-bindenden RGD-Motiv oder alternativen Sequenzen neue Bindungsliganden in den Knopf des Vektors eingebracht wurden (Magnusson et al., 2001; Gaden et al., 2004).

Einen alternativen Weg, die Spezifität der Transduktion zu erhöhen, stellt der Ansatz dar, die Expression entsprechender Rezeptoren auf den Zielzellen zu erhöhen, z. B. durch Aktivierung der Integrin αvβ3-Expression von peripheren Lymphozyten durch Einsatz von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) (Shuang et al., 1995).

Die Methode des nicht-genetischen Retargeting beinhaltet die Entwicklung von Retargeting-Komplexen oder Pseudorezeptoren, die im Sinne von bispezifischen Antikörpern simultan spezifische Kapsomere oder in Kapsomere des Virions eingebrachte Epitope und Oberflächenmoleküle der gewünschten Wirtzelle erkennen (Douglas et al., 1996; Rogers et al., 1997; Miller et al., 1998; Einfeld et al., 1999; v. Beusechem et al., 2002).

Dmitriev et al. entwickelten ein bispezifisches Targeting-Protein, das aus der Ektodomäne des Coxsackie- und Adenovirusrezeptors in Fusion mit EGF (Human epidermal growth factor)-Molekülen besteht. Dieses rekombinante Fusionsprotein blockierte die native, Zell-bindende Domäne des Fiberknopfes und ermöglichte ein vom Coxsackie- und Adenovirus-rezeptor unabhängiges Targeting des Vektors. Als Ligand wurde EGF ausgewählt, weil EGF-Rezeptoren auf einer Vielzahl von Tumorzellen in hoher Dichte exprimiert werden. Ein in der Effizienz deutlich gesteigerter Gentransfer in bestimmte Tumorzelltypen, die EGF in großem Umfang exprimieren, konnte so erzielt werden (Dmitriev et al., 2000). Einen ähnlichen Ansatz verfolgt die Verwendung bifunktionaler Polyethylenglycol-Moleküle, die mit der einen funktionellen Gruppe mit dem Kapsid des

Adenovirus-DISKUSSION

Eine weitere Möglichkeit des nicht-genetischen Retargeting findet mittels Einsatz Tumor- oder Gewebespezifischer Promotoren auf der Ebene der Transkription statt, so daß die Replikation des Vektors und/oder die transgene Expression ausschließlich in Tumorzellen stattfinden kann (Doronin et al., 2001).