Repertoire der Tumor-spezifischen T-Zellen

Frühere Arbeiten mit murinen T-Zellklonen haben gezeigt, dass verschiedene Peptide, die von denselben T-Zellklonen erkannt werden, ihrerseits unterschiedliche Repertoires an T-Zellen ansprechen (Gundlach, et al., 1996). Diese Veröffentlichung stimmt mit Beobachtungen für humane Tumor-spezifische T-Zellen überein, die in Zusammenhang mit vakzinationstherapeutischen Eingriffen bei Melanompatienten durchgeführt wurden. Bei der Untersuchung der Frequenzen von CD8⁺-T-Zellen mit Spezifität für das MART/Melan-A-Epitop AAGIGILTV bzw. eines Mimotops dieses MART/Melan-A-Epitops, ELAGIGILTV, zeigte sich, dass nach ex vivo Stimulation mit dem Mimotop mehr T-Zellen IFNg produzieren als mit dem natürlichen Epitop (Trefzer et al., 2004). Diese Beobachtung zeigt, dass mit den Mimotopen andere oder mehr T-Zellen angesprochen werden können als mit den natürlichen Epitopen.

Dies deutet auf die Möglichkeit hin, mit dem natürlichen Epitop in vivo geprimten T-Zellen, d.h. durch die Tumorzellen möglicherweise auch anerg gewordene T-Zellen, durch Mimotope effektiver stimulieren zu können. ELISpot-Analysen mit PBMC des Patienten WeW nach der Stimulation mit den Epitopen und Mimotopen, die für Klon L1 (Abb. 14) bzw. für Klon PN2 (Abb. 15) definiert wurden, zeigen, dass nahezu alle Peptide auch hier aktiv sind, also die korrespondierenden T-Zellen auch im peripheren Blut zirkulieren und die Spezifitäten der beiden Klone L1 und PN2 repräsentativ für die Spezifitäten dieser zirkulierenden T-Zellen sind. Gleichzeitig ist deutlich, dass die Peptide sich sehr stark darin unterscheiden, wieviele T-Zellen jeweils stimuliert werden können. Ein Vergleich des Spezifitätsprofils mit den Spezifitätsprofilen, die für die Klone L1 (Abb. 14) und PN2 (Abb. 15) bestimmt wurden, läßt die Unterschiede deutlich werden.

Es gibt eine Reihe von Peptiden, die effektiv die Klone stimulieren aber nicht die T-Zellen aus PBMC und umgekehrt. Peptide 55, 31, 60, 7, 36, 39, und 47 sind Beispiele für den ersten, Peptide 26, 53, 52, 67 und 68 Beispiele für den zweiten Fall. Der PBMC-T-Zellpool enthält also T-Zellen, welche die für die Klone L1 und PN2 definierten Epitope und Mimotope mit anderen Preferenzen erkennen, also unterschiedliche Feinspezifitäten aufweisen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es möglich ist, durch Kombination der unterschiedlichen

Peptide, die die gleiche T-Zellspezifität repräsentieren, ein erweitertes T-Zellrepertoire anzusprechen.

Abbildung 14: Repertoireanalyse der L1-peptidspezifischen T-Zellen im peripheren Blut des Patienten WeW per ELISpot. In der vertikalen Achse ist SFU pro 1x106 CD8+-T-Zellen angezeigt. Die Peptidsequenzen sind in Tabelle 9 aufgelistet.

Da zum Nachweis der Tumor-spezifischen T-Zellen in peripheren Bluten ein ELISpot-Assay auf IFNg verwendet wurde, sind die so nachgewiesenen T-Zellen nicht anerg. Die Kombination verschiedener Peptide zur Stimulation eines T-Zellpools gegen den Tumor könnte damit helfen, das Problem zu umgehen, dass ein Teil der Tumor-spezifischen T-Zellen im Tumor anerg ist, d.h. Mimotope könnten es möglich machen, einen aktiven T-Zellpool für die Bekämpfung des Tumors zu rekrutieren.

0 500 1000 1500 2000

532 526 520 482 481 370 364 363 354 351 348 347 339 337 329 153 57 54 50 40 39 34 32 6

Peptide

SFU/1x106

Abbildung 15: Repertoireanalyse der PN2-Peptid-spezifschen T-Zellen im peripheren Blut des Patienten WeW per ELISpot. In der vertikalen Achse ist SFU pro 1x10⁶ CD8⁺-T-Zellen angezeigt. Peptidsequenzen sind in Tabelle 7 aufgelistet.

Experimente und Ergebnisse

Um die Spezifität Mimotop-induzierter T-Zellen weiter zu untersuchen, wurden mit den Mimotopen Peptide Nr. 347 und 352 sowie den potentiellen natürlichen Epitope Peptide Nr.

22, 258, 276 PBMC aus zwei HLA-A*0201 positiven gesunden Spender in vitro induziert.

Dazu wurden CD8⁺-T-Zellen aus PBMC positiv magnetisch isoliert und die CD8^--Fraktion mit 10 µg/ml Peptid inkubiert, bestrahlt und den CD8⁺-T-Zellen als Stimulatorzellen zugemischt. Die Zellen wurden nach 10 bis 14 Tage restimuliert und nach jeder Stimulation in ELISpot-Assays getestet. Bei den Peptiden Nr. 22, 258 und 276 konnte nach zwei Stimulationen keine spezifische T-Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte bei den Mimotopen Nr. 347 und 352 spezifische T-Zelllinien etabliert werden. Die PBMC waren vorher in ELISpot-assays mit negativen Ergebnissen auf die Peptide Nr. 22, 258, 276, 338, 339, 340, 341, 347, 348, 351 und 352 getestet worden. In diesen Induktionsversuchen konnte also nur mit Mimotopen eine spezifische T-Zellreaktion induziert werden. Für den Vergleich der Spezifitätsrepertoire der T-Zelllinien wurden diese bei einer E/T-Ratio von 20:1 in Chromfreisetzungsversuchen getestet. Dabei wurde T2-Zelllinie mit je 10µg/ml Peptid beladen und als Zielzellen eingesetzt. Abb. 16 zeigt die normaliserten Werte der spezifischen Chromfreisetzungswerte für die einzelnen Peptide. Die mit den Peptiden 347 und 352 induzierten T-Zelllinien erkannen auch alle anderen Mimotope (Peptide Nr. 338, 339, 340, 341, 348 und 351). Die potentiellen natürlichen Epitope 22, 258 und 276 wurden von T-Zelllinie aus Spender A erkannt aber nicht von der Linie aus Spender B. Insgesamt sind sich die Spezifitätsprofile der beiden mit unterschiedlichen Mimotopen induzierten T-Zelllinien aus Spender A sehr ähnlich, während die T-Zelllinien aus Spender B deutlich davon abweicht.

Das Profil des Klons PN2 ist gegenüber den Profilen der T-Zelllinien des Spenders A sehr eingeschränkt aber vollständig von den Profilen der Mimotop-induzierten Linien abgedeckt.

Insgesamt erwiesen sich die Mimotope in diesen Versuchen als potente Induktoren von T-Zellreaktionen mit breiten Spezifitätsprofilen.

Experimente und Ergebnisse

67 Sequenz1234NrSequenz1234NrSequenz1234NrSequenz1234NrSequenz1234RLLYWNRKL91998185459KAQAWIADV614641317RAPAWTPTL2145034463KAVGWGATV8610010KALFWVAVA16600RLSFWQQKL9980657757RVRAWQRGA2434317145RANHWSAII161272030RAACWHLVA343200502RAPFWGLRV18300RLSWWQQKL55937178368RVTNWNRKL6965071267KLKFWTVDL1518660124KALQWVSAI60590275KLQNWMRSL121000RLNFWQQKL61698477360RVCDWHSDL4973076321RASAWMLKL1638044290KVMAWCLAL26300252KAYGWCSEL14700RVSWWGSTL54826588365RVNGWSLPL3772083129KISNWTAAI1849310322RAWAWTELL155000369RVVGWVPVL101100RLNFWQHKL81717464344RLQDWMRSL507205947RLTFWTCLA163646012KICAWMQLA05590273KLPDWLPQL13800RLNWWQQKL62837073371RVWAWVPLL3743099269KLLHWVSLL13480025KVIFWSALA13051020KLLDWLEDA15600RLNWWQHKL56807477332RLKPWLVGL2855086469KISAWHNNV9682035RAQGWARDA184200125KANDWLQFI16200RLRHWVYLL48568894342RLPAWALVL3173056490RADFWMPAV321730508RAVFWIEFV8470011KAQPWLFDA13500RLSWWQHKL69857548324RIIPWIQQL2831097319RAQEWMEAL1555027270KLMAWNFLL84700131KLIPWVQKI13500RLSFWQHKL81547268330RLCPWGTHL2635094529RVLAWSIGV245901436RARAWLRLA203400123KALEWVSAI10700RVCYWTIRV45699956320RAQPWALLL4134080522RLRAWGARV21383304KAADWLFSA421100268KLLCWLCTL13400RVLYWIPVV41678078316RAPAWLRRL4165050504RAQFWSAYV761240148RAWNWSNSI143700121KALEWLALI10600RVSHWMLGV28618783482KLPNWQMEV425161051RLWDWVPLA3726022247KAMPWALSL123800255KINNWIVQL10600RLYYWGLGL35379093312RALDWTEKL5137067327RIPEWGQDL1343028530RVLCWIVLV347008KAKAWSHMA10500RVLFWGRIL70553483362RVLDWVPWL285806433RAKYWVERA1831350517RLLEWLPDV163100256KISDWALKL6900RLVYWLHTL42485193353RLVNWSCTL1953076313RALEWLAWL196005281KLWEWCLGL42500263KLKDWIENL12300RVAFWIIKL38664681343RLPAWQPIL2956061291KVRAWGPGL2031031506RARDWLQDV83800471KITPWSSKV11300RVLPWQAQV49424790262KLDYWSSQL1957700288KVINWQTSL1015540146RAQAWSRDI12330014KIPNWLYLA12100RVVPWNVTL44496371524RLTPWIVAV2640076258KISGWTQAL1015520134KLWEWCIGI37600138KVLEWIASI11200RLQNWVYNV56572681336RLLAWVLWL2052068279KLSEWMESL1649110259KLAAWIQKL132900122KALEWLARI10200RLRWWQPFV21639240334RLLAWLIFL274606738RARGWAAAA282701842RIPEWLFVA172400483KLPPWNPQV5700RLSHWGRRL5354278156RVNAWQAKA5225590150RLCHWGPII204207156RVNEWVIFI142700149RIYDWLQRI9300RLNWWSTV5588268315RAPAWAAGL148103927KVKCWGPGA222301921KLLGWTHCA150260468KIPGWQAEV9100RVAAWVEAL34691495333RLLAWCFLL3639059462KASEWVQQV912041287KVICWVCEL13270048RLVDWLRYA6300RLNWWVSV50396851512RISAWQSPV1468490507RASFWLALV54610015KLAEWGPLA201800246KACPWAHFL7100RVVGWSNIV26496461458KAKYWSSNV1043770310RADEWACEL153608272KLNEWLAKL201700464KIIDWIPKV3500RVLDWVPKL496348455RVLPWALVA55110637KAKAWALVA148020264KLKEWSLIL102600136KVINWHMKI5100RIDWWGFRV5668542271KLNCWGSRL275950277KLRNWHHGL28750257KISEWQVKL171900461KAREWTAKV5100RLSNWNISL50662060345RLRAWLREL2052050472KIVDWAIQV72310265KLKEWSLVL92700477KLKFWTHCV50000RLWGWASPL3069108322KLQFWAVTA1838640476KLAPWQRQV24870154RVMCWLFLI62900133KLNEWGTII48000RLICWQALL315712846KADWWTNTA1721810481KLLYWNMAV22250505RARAWCEMV33200318RAQAWGERL03100RIQFWIAAV59413546261KLDYWSFQL113771013KINNWLNHA101150289KVKDWVERL201500487KVAFWLELV02900RIPPWMEVV2442615134RALWWAVGA22385809KAKYWSTNA121001250KATWWCSGL201500474KIWEWLVGV18000RVPAWGRCL46581162311RAKDWCEEL3861019484KLQGWQMGV13100384KAAYWASQV132100155RVNDWLLRI13000RITYWGQRL24426149276KLRHWQQVL502146041RIPDWTPQA514900253KICAWMQLL191500140KVTPWLRTI12000RVMGWVSGL39471575314RALPWLPWL2635054309RAAFWNHVL53390037RAREWLLDA211200132KLKPWLLEI0600RVDFWTSTI27138448335RLLAWSWCL262306643RLAAWARRA57320023KLREWLETA23800475KLAFWLLAV6000RLQHWLWSI28402265130KITWWLCAI113667052RVAAWSAWA256400260KLDNWLNEL181200127KAVEWLAHI4000RVCCWTPRL2647954307RAADWAEAL1378022147RASAWHPRI404600139KVQNWNSEI82000486KLSEWVYLV40009307025514RIYAWQMAV1955040151RLQEWCSVI136700465KIIPWNSRV91900467KINEWLTLV30004932404328RITNWNRKL543802131RAKDWLPGA38410017KLIDWLEDA23400120KALEWLAFI3000302961544RLAPWLLRA548050466KILPWINQV40740137KVKEWSLMI12500473KIVDWALSV20001229757513RISPWLLRV2435051308RAAEWLFPL145900249KASAWQRNL19700480KLLFWVTEV20001531561853RVKGWAPRA4736270274KLPHWTPTL190530460KARAWIADV14100029KVRGWSRPA020058729746RLLGWSLPA2540420533RVMEWLRSV135900470KITPWSSEV121100485KLRDWHHEV0200RVIFWSLYV23150105KADAWAVGA181507028KVPEWQRLA611000266KLKEWVQKL81500479KLKPWLLEV0000RVLAWMFLV133837354RVLGWVAEA3253180126KAPHWTNRI60660248KAPFWCPIL11120024KLYNWLRVA0000

Experimente und Ergebnisse

Abbildung 16: Vergleich der Spezifitätsrepertoires der Mimotop-induzierten T-Zelllinien und des CTL-Klons PN2. Die mit 1 bis 4 numerierten Spalten zeigen die Aktivität der T-Zellen in Zytotoxizitätsanalysen mit T2-Zellen als Zielzellen: Spalte 1-mit Peptid 347 induzierte T-Zelllinie aus Spender A; Spalte 2-mit Peptid 352 induzierte Zelllinie aus Spender A; Spalte 3-Klon PN2; Spalte 4-mit Peptid 347 induzierte T-Zelllinie aus Spender B. Zytolysedaten sind entsprechend der Zahl der reaktiven T-T-Zelllinie farblich wie folgt dargestellt: rot - von allen 4 Zelllinien erkannt; grün - von 3 Zelllinien erkannt, blau - von 2 T-Zelllinien erkannt; gelb - von einer T-Zelllinie erkannt. Die spezifischen Chromfreisetzungswerte sind auf 100% normalisiert (maximaler Chromfreisetzungswert > 30%). Die T-Zellreaktionen sind mit steigender Farbintensität (0-33%, 34-66%, 67-100%) in Abstufen dargestellt.

5.5 Induktion von Tumor-reaktiven T-Zellen in vivo durch Mimotopenvakzination