4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.3 Rekonstitution von A. aeolicus RNase P
In dieser Arbeit konnte erstmals RNase P-Aktivität in rekonstituierten Holoenzymen von A.
aeolicus nachgewiesen werden. Der Nachweis wurde mit partiell vorgereinigten RNA- und Protein-Präparationen (3.2.7.3) geführt.
Nachdem in Vorexperimenten die Rekonstitution von RNase P-aktiven Holoenzymen aus Aceton-gefällter Protein-Fraktion und Magnesiumacetat/Essigsäure-gefällter RNA-Fraktion
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gelungen war (3.2.6.5.1), wurde die Magnesiumacetat/Essigsäure-gefällte RNA vor den Rekonstitutionsversuchen zusätzlich Phenol/Chloroform-extrahiert, um eventuell vorhandene restliche Proteinkontaminationen vollständig abzutrennen. Für die Holoenzym-Rekonstitution wurden die RNA-Fraktion und Protein-Fraktion in einem Reaktionsansatz vereinigt und auf RNase P-Aktivität getestet (3.2.6.5.2). Die Experimente wurden mit RNA- und Protein-Komponenten durchgeführt, die entweder aus Eluat-Fraktionen des 2. Aufreinigungsschrittes (Hydrophobe Interaktions-Chromatographie [HIC]) oder des 3. Aufreinigungsschrittes (Größenausschluss-Chromotographie [GAC]) aufbereitet worden waren. Durch Anlegen eines Stufengradienten mit absteigenden Konzentrationen (NH4)2SO4 konnten insgesamt 5 Elutionsfraktionen von der HIC-Aufreinigung erhalten werden (4.1.4.2). Die RNase P-Aktivität eluierte nahezu vollständig in zwei separaten Fraktionen, wobei eine Fraktion bei Stufe 3 [Elution bei 0,4 M (NH4)2SO4] eluierte und die andere Fraktion bei Stufe 4 [Elution bei 0,2 M (NH4)2SO4]. Die RNase P-aktiven Elutionsfraktionen dieser beiden Stufen wurden im Anschluss nochmals separat auf einer Superose 6-Größenauschluss-Chromatographie-Säule aufgetrennt (4.1.5.1.4). Aus den verschiedenen Elutionsfraktionen wurden, wie eingangs beschrieben, jeweils die RNA- und Protein-Komponenten für die Rekonstitutionsexperimente präpariert. Als Kontrolle wurden zusätzlich die entsprechenden Komponenten aus HIC-Eluaten der RNase P-inaktiven Stufe 2 [Elution bei 0,6 M (NH4)2SO4] präpariert. Die extrahierten A. aeolicus RNA-Fraktionen wurden im Enzymtest in Endkonzentrationen von 20 – 30 ng/µl und die Aceton-gefällten A. aeolicus Protein-Fraktionen in Endkonzentrationen von 40 – 60 ng/µl eingesetzt. Für jede zu analysierende Aufreinigungsfraktion wurden drei Enzymtests angesetzt: [1] ein Ansatz mit vereinigter RNA- und Protein-Präparation zur Holoenzym-Rekonstitution (HE); [2] ein Ansatz mit der RNA-Präparation (R) und [3] ein Ansatz mit der Protein-RNA-Präparation (P). Als Positivkontrolle diente ein Reaktionsansatz mit dem Holoenzym von B. subtilis (Endkonzentration im Enzymtest: 6,4 nM). In einer weiteren Kontrolle wurde parallel die Aktivität der B. subtilis P RNA (PR) (Endkonzentration im Enzymtest: 8 nM) bestimmt.
Ein repräsentatives Ergebnis der Rekonstitutionsexperimente ist in Abbildung 4.6 gezeigt.
Für die analysierten Zelllysate, aus denen die RNA- und Protein-Komponenten präpariert wurden, ist die entsprechende Elutionsstufe der HIC-Aufreinigung und der Aufreinigungsgrad angegeben. Der Aufreinigungsgrad zeigt an, welche Aufreinigungsschritte das jeweilige Zelllysat insgesamt durchlaufen hat. SA und SB sind Aliquots aus den Substrat-Mixen für die A. aeolicus Rekonstitutionsexperimente bzw. B. subtilis Positivkontrolle, die nicht mit RNase P-aktiven Komponenten inkubiert wurden.
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Abbildung 4.6: Rekonstitution von RNase P-aktiven Holoenzymen (HE) aus extrahierten A. aeolicus RNA (R)- und Protein (P)-Präparationen unterschiedlicher Aufreinigungsgrade (DEAE: Anionenaustausch-Chromatograpgie. HIC: Hydrophobe Interaktions-Chromatographie. GAC: Größenausschluss-Chromatographie).
Zusätzlich wurden die A. aeolicus RNA-Präparationen und Protein-Präparationen allein auf RNase P-Aktivität getestet. Die Stufen 2 – 4 geben an, bei welcher HIC-Elutionsstufe die verwendeten A. aeolicus-Fraktionen eluierten. Das B. subtilis Holoenzym wurde als Positiv-Kontrolle eingesetzt. Als zusätzliche Kontrolle wurde B.
subtilis RNase P RNA allein mit dem Substrat unter identischen Bedingungen inkubiert (PR). Aliquots aus den Substrat-Mixen für die A. aeolicus- (SA) und B. subtilis- (SB) Reaktionsansätze dienten als Negativ-Kontrollen.
Die Inkubation erfolgte in 1x Puffer A0 mit 4,5 mM Mg2+ für 15 - 30 min.
Die Rekonstitution von RNase P-aktiven Holoenzymen durch Kombination von RNA- und Proteinpräparationen aus aufgereinigten Zelllysaten bringt den erstmaligen Nachweis für die Beteiligung sowohl einer RNA- als auch einer Protein-Komponente an der RNase P-Aktivität in A. aeolicus. RNase P-Aktivität konnte bei Holoenzymen nachgewiesen werden, die aus RNA- und Protein-Proben sowohl der HIC-Aufreinigung (Elutionsstufe 3 und 4) als auch der entsprechenden Größenausschluss-Chromotographie rekonstituiert wurden. Bei der Vereinigung von RNA- und Protein-Proben aus Eluaten der RNase P-inaktiven HIC-Stufe 2 hingegen konnte keine RNase P-Aktivität gemessen werden. Wurden die präparierten RNA- und Protein-Komponenten getrennt voneinander getestet, so konnte in diesen Reaktionsansätzen - mit einer Ausnahme - ebenfalls keine RNase P-Aktivität detektiert werden. Die Beobachtung, dass die auf HIC Stufe 4-Fraktionen basierenden Protein-Proben eine schwache RNase P-Aktivität aufwiesen, könnte durch eine unvollständige Abtrennung der RNA-Komponenten während der Fällung bzw. Extraktion erklärt werden. Solch eine Protein-allein Reaktion wurde reproduzierbar bei den aus Stufe 3-Elutionsfraktionen aufbereiteten Protein-Proben nicht beobachtet. Im Hinblick auf eine mögliche RNA-Kontamination wurde das RNA : Protein Verhältnis in den einzelnen Proben der Aceton-gefällten Proteine mittels photometrischer Messung bestimmt. Während das Verhältnis für Protein-Proben aus Stufe 3-Fraktionen bei A260 : A280 = 0,9 - 1 lag, war es bei Stufe 4-Fraktionen auf 0,5 – 0,6 erniedrigt. Folglich unterschieden sich die Protein-Proben der verschiedenen HIC-Elutionsfraktionen in Bezug auf das RNA : Protein Verhältnis voneinander. Entgegen den Überlegungen enthalten die aus Stufe 4-Eluaten präparierten Proteine jedoch einen geringeren Anteil an Nukleinsäuren als die aus Stufe 3-Eluaten präparierten Proteine. Über die Identität der Nukleinsäuren können jedoch keine Angaben gemacht werden. Wie unter 4.1.6 diskutiert, gibt es experimentelle Hinweise, dass die RNA-Protein-Interaktion in der A. aeolicus RNase P relativ stark ist. So besteht die Möglichkeit, dass der RNase P-Ribonukleoproteinkomplex in den bei Stufe 4 von der HIC-Säule eluierten
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Fraktionen und der anschließenden Aceton-Fällung nicht vollständig aufgetrennt werden konnte. In diesem Fall könnte eine Protein-allein Aktivität vorgetäuscht werden.
Es wurden zusätzliche Holoenzym-Rekonstitutionsversuche mit RNA-Proben vorgenommen, die direkt aus DEAE-Fraktionen Phenol/Chloroform-extrahiert wurden. In diesem Fall war die RNA weder mit hohen Konzentrationen Ammoniumsulfat noch mit Magnesiumacetat/Essigsäure behandelt worden. Die nach dieser Methode präparierte RNA (Endkonzentration im Prä-tRNA-Prozessierungsansatz: 100 ng/µl) wurde mit Aceton-gefälltem Protein (Endkonzentration im Prozessierungsansatz: 300 ng/µl) vereinigt und auf RNase P-Aktivität hin untersucht. Der Enzymtest fiel negativ aus. Dieses Ergebnis stimmt mit der Beobachtung überein, dass die RNA-Komponente der A. aeolicus RNase P nur in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen effektiv extrahiert werden kann (4.1.6). Eventuell gelingt während einer einfachen Phenol/Chloroform-Behandlung keine effektive Abtrennung der RNase P Proteine von der RNA-Komponente und es kommt bei den Phasentrennungen zu einem Verlust der Ribonukleoproteinkomplexe.
4.3.1 Heterologe Rekonstitutionen von A. aeolicus RNase P
Neben der homologen Rekonstitution von RNase P-aktiven Holoenzymen aus RNA- und Protein-Komponenten von A. aeolicus (4.3) wurden auch heterologe Rekonstitutionsversuche durchgeführt. Dadurch wurde indirekt auch getestet, ob es sich bei der A. aeolicus RNase P um ein klassisches bakterielles RNase P-Enzym handelt. Bei diesen Versuchen wurden entweder A. aeolicus RNA-Komponenten mit dem B. subtilis P Protein oder B. subtilis P RNA mit A. aeolicus Protein-Komponenten vereinigt und auf RNase P-Aktivität getestet.
In solch einem Experiment wurde Magnesiumacetat/Essigsäure-gefällte RNA von A. aeolicus aus einer HIC-Elutionsfraktion (Endkonzentration im Ansatz: 90 ng/µl) mit dem P Protein von B. subtilis (Endkonzentration im Ansatz: 340 nM) kombiniert. Die hierbei verwendete RNA-Probe war nicht zusätzlich Phenol/Chloroform-extrahiert worden, aber die Rekonstitution von homologen RNase P-aktiven Holoenzymen mit A. aeolicus Protein-Komponenten war mit dieser RNA bereits bereits erfolgreich gewesen. Nach der heterologen Rekonstitution dieser RNA mit dem B. subtilis P Protein konnte im anschließenden Enzymtest jedoch keine RNase P-Aktivität detektiert werden.
In einem weiteren Rekonstitutionsansatz wurde Phenol/Chloroform-extrahierte RNA von A.
aeolicus aus einer RNase P-aktiven DEAE-Elutionsfraktion (Endkonzentration im Ansatz: 90 ng/µl) mit dem B. subtilis P Protein (Endkonzentration im Ansatz: 340 nM) kombiniert. Die für diesen Versuch verwendete RNA-Probe war nicht mit hohen Salzkonzentrationen ((NH4)2SO4 oder Mg(OAc)2/CH3COOH) behandelt worden. Jedoch konnte mit dieser RNA-Fraktion weder ein homologes noch ein heterologes Enzym mit messbarer RNase P-Aktivität rekonstituiert werden.
Durch die Kombination der B. subtilis P RNA (Endkonzentration im Ansatz: 20 nM) mit Aceton-gefälltem Protein aus einer RNase P-aktiven HIC-Elutionsfraktion (Endkonzentration im Ansatz: 300 ng/µl) konnte ebenfalls keine RNase P-Aktivität rekonstituiert werden, obwohl mit der verwendeten A. aeolicus Protein-Komponente die Rekonstitution homologer RNase P-aktiver Holoenzyme erfolgreich gewesen war.
Die konservierte Funktion bakterieller RNase P Proteine und RNAs konnte in heterologen Komplementationsstudien sowohl in vitro als auch in vivo demonstriert werden (Guerrier-Takada et al. 1983), (Waugh and Pace 1990), (Wegscheid et al. 2006), (Gößringer and
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Hartmann 2007). Folglich deuten die Ergebnisse der hier durchgeführten heterologen Rekonstitutionsversuche darauf hin, dass es sich bei der RNase P-Aktivität aus A. aeolicus um kein konventionelles bakterielles RNase P-Enzym handelt. Diese Interpretation wird dadurch gestützt, dass trotz intensiver bioinformatischer Analyse des Genoms von A.
aeolicus kein Gen für eine bakterielle P RNA oder ein bakterielles P Protein identifiziert werden konnte (Hartmann and Hartmann 2003), (Li and Altman 2004a), ((Lechner, Nickel, Wehner et al., im Druck), siehe Anhang 7.4).