4.5.1 Serumgewinnung aus Vollblut
Für die Serumgewinnung der Blutproben von Mäusen wurde das entnommene Blut in 1,5‐ml‐
Reaktionsgefäßen bei 12.800 · g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Blutproben von Frettchen und Kaninchen wurden mit 2‐, 5‐ oder 9‐ml‐Serum‐Vacutainerröhrchen entnommen und bei 1.800 · g für 15 Minuten zentrifugiert, das Serum abgenommen und bei 4 °C für kurze Zeit aufbewahrt oder bei –20 °C eingelagert.
4.5.2 Zwei‐Schritt‐Ammoniumsulfat‐Präzipitation
Für die Isolierung und Reinigung der IgG‐Antikörper aus den Hyperimmunseren von Kanin‐
chen wurde ein mehrstufiges Verfahren optimiert. Serumproteine mit einer geringeren Löslichkeit als IgG wurden unter Rühren durch tröpfchenweise Zugabe von 0,864 M Ammoni‐
umsulfat bei einer Sättigung von 20 % präzipitiert und der Ansatz bei 4 °C für 6 Stunden
inkubiert. Die ausgefallenen Proteine wurden durch Zentrifugieren bei 3.000 · g und 4 °C für 20 Minuten entfernt und IgG‐haltige Lösung auf eine Ammoniumsulfat‐Konzentration von 1,944 M eingestellt, um Proteine wie IgG zu präzipitieren, die bis zu einer Sättigung von 40 % ausfallen. Nach Inkubation bei 4 °C für 6 Stunden wurde das ausgefallene IgG durch Zentrifugieren bei 3.000 · g und 4 °C für 20 Minuten von den löslichen Proteinen getrennt und in 0,1 M Tris‐HCl im ursprünglichen Volumen der Serumprobe gelöst. Die optimalen Ammoniumsulfat‐Sättigungen wurden im Zuge dieser Arbeit empirisch ermittelt.
4.5.3 IgG‐Affinitätschromatographie und Pufferaustausch
Für eine angeschlossenen IgG‐Affinitätschromatographie wurde der Puffer des gelösten Präzipitats mittels Dialyse gegen TBS‐Puffer (pH 7,4) ausgetauscht. Hierzu wurden Dialysekassetten mit einem Molekulargewichtsausschluss (MWCO) von 20 kDa in dem 300‐
fachen Puffervolumen der Probe verwendet. Die Dialyse wurde bei 4 °C durchgeführt und der Puffer wurde nach 2,4 und 6 Stunden gewechselt, bevor der letzte Dialyseschritt über Nacht lief.
Das IgG wurde unter Verwendung von Protein‐A‐Säulen gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit einigen Modifikationen isoliert. Kurz zusammengefasst: Das dialysierte Präzipitat (in der Regel 5 ml) wurde durch eine 1,2‐ und eine 0,2‐µm‐Membran filtriert, mit dem doppelten Volumen Binde‐/Waschpuffer gemischt und bei 150 · g und RT für 30 Minuten zentrifugiert, um das IgG an die nach Angaben des Herstellers aktivierte Protein‐A‐Säule binden zu lassen. Der Durchfluss wurde erneut auf die Säule geladen und ein zweites Mal zentrifugiert, bevor achtmal mit Binde‐/Waschpuffer gewaschen und bei 500 · g für 3 Minuten zentrifugiert wurde. Das IgG konnte mittels Elutionspuffer von der Säule eluiert werden und der vorgelegte Neutralisationspuffer regulierte den pH auf ungefähr 7,5. Nach der Affinitätschromatographie war das IgG im doppelten Volumen des eingesetzten Präzipitats (also in der Regel 10 ml) gelöst.
Maus‐IgG wurde analog dem oben beschriebenen Protokoll mittels Protein‐G‐Säulen und den entsprechenden Puffern isoliert (Tabelle 22).
Für die Konzentration des gelösten IgGs auf das ursprüngliche Probenvolumen und den anschließenden Pufferaustausch wurden Vivaspin‐Zentrifugensäulen mit einem MWCO von 50 kDa entsprechend den Vorgaben des Herstellers Sartorius verwendet. Das konzentrierte IgG wurde für die Immunisierung in PBS oder in 20 mM Natriumacetatpuffer zur Herstellung von F(ab')2‐Fragmenten gelöst.
Tabelle 22: Zusammensetzungen der Puffer für die IgG‐Affinitätschromatographie Bezeichnung Anwendung Zusammensetzung
Binde‐/Waschpuffer (pH 9) Protein‐A‐Säule 1,5 M Glycin/NaOH, 3 M NaCl Binde‐/Waschpuffer (pH 7,4) Protein‐G‐Säule 0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl Elutionspuffer (pH 2,5) Protein‐A/G‐Säule 0,2 M Glycin/HCl
Neutralisationspuffer (pH 9) Protein‐A/G‐Säule 1 M Tris/HCl, pH 9,0
TBS‐Puffer Proteinreinigung 100 ml 10x TBS (pH 7,4) in 900 ml RW
4.5.4 Quantifizierung des Protein‐ und IgG‐Gehalts
Neben der Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration von eingesetzten Seren, den Intermediaten der Antikörperreinigung und Modifikation sowie den Endprodukten unter Verwendung des detergenzkompatiblen BCA Protein Assay Kits von Pierce (siehe 4.3.1) wurde mittels ELISA‐Sets von Bethyl die enthaltene Menge Kanninchen‐IgGs nach Herstellerangaben in Serum und Intermediaten der Antikörperreinigung quantifiziert. Die Komponenten des Sets sind in Tabelle 23 aufgeführt. Jede Vertiefung der MaxiSorp 8‐Loch‐Streifen wurde mit 1 µg Beschich‐
tungsantikörper in 100 µl Beschichtungspuffer bei RT für 1 Stunde inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit 200 µl Waschpuffer je Vertiefung wurde die Platte mit 200 µl Block‐Puffer bei RT für 30 Minuten inkubiert und erneut fünffach gewaschen, bevor 100 µl der Standardreihe und der zu testenden Proben in Duplikaten überführt wurden. Für die Standardreihe von 7,8–
500 ng/ml wurde das Kaninchen‐Referenzserum in Probenpuffer verdünnt. Die zu testenden Proben wurden 104 bis 107 in Probenpuffer verdünnt, um zu ermitteln, welche Verdünnung in die Spanne des Standards passt. Nach Inkubation bei RT für 1 Stunde wurde die Platte fünffach gewaschen und mit 100 µl des 1:200.000 (v/v) in Probenpuffer verdünnten HRP‐konjugierten Sekundärantikörpers je Vertiefung für 1 Stunde bei RT inkubiert. Nach neuerlichem fünffachen Waschen wurde die Platte mit 100 µl der TMB‐Lösung je Vertiefung gefärbt und die Farb‐
reaktion nach 15 Minuten Inkubation im Dunkeln durch Zugabe von 100 µl Stopplösung je Vertiefung beendet, bevor die Absorption bei einer Wellenlänge von λ = 450–630 nm gemessen wurde. Zur Quantifizierung der IgG‐Konzentration wurde jede Probe in Duplikaten analysiert und vom Mittelwert der Leerwert ohne Serumzugabe subtrahiert.
Tabelle 23: Komponenten für den ELISA zur Quantifizierung von Kaninchen‐IgG Bezeichnung Zusammensetzung
Beschichtungsantikörper 1 mg/ml α‐Kaninchen‐IgG‐Fc (aus der Ziege) Beschichtungspuffer (pH 9,6) 0,05 M Hydrogencarbonat
Blockpuffer (pH 8,0) 50 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 % BSA
Detektionsantikörper 1 mg/ml anti‐Kaninchen‐IgG‐Fc, HRP‐konjugierte (aus der Ziege) Probenpuffer (pH 8,0) 50 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 % BSA, 0,05 % Tween 20
Referenzserum Kaninchen 6,3 mg/ml IgG
TMB‐Färbelösung Flüssigsubstrat TMB, fertige Färbelösung Waschpuffer (pH 8,0) 50 mM Tris, 0,14 M NaCl, 0,05 % Tween 20 Stopplösung 0,18 M H2SO4
4.5.5 Enzymatische IgG‐Spaltung mit Pepsin
Für die Erzeugung von F(ab')2‐Fragmenten wurde gereinigtes und in 20 mM Natriumacetat‐
puffer (pH 4) gelöstes IgG in einem 1:40‐Verhältnis (w/w) mit Pepsin (> 2.500 U/mg) gemischt und bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Die optimale Inkubationszeit wurde zuvor empirisch ermittelt. Die enzymatische Spaltreaktion wurde durch Zugabe des entsprechenden Volumens Tris‐Base (pH 11,24) auf pH 7,4 eingestellt und damit gestoppt. Die F(ab')2‐Fragmente (~ 88 kDa) wurden von nicht verdautem IgG (~ 150 kDa) mittels Vivaspin‐Zentrifugensäulen mit einem 100 kDa MWCO getrennt. Anschließend wurden die F(ab')2‐Fragmente durch eine Säule mit einem MWCO von 50 kDa vom Pepsin (~ 35 kDa) und den Spalt‐Peptiden isoliert, auf das ursprüngliche Volumen konzentriert und in PBS gelöst.