4. ERGEBNISSE
4.7. Genexpressionsanalyse
4.7.1. Regulierte Gene nach Bestrahlung
Um statistisch signifikante Expressionsunterschiede von nicht bestrahlten und bestrahlten Zellen zu erkennen, wurde ein „t-Test“ durchgeführt (Abb. 22). Nur Gene mit einer Signalintensität > 100 wurden berücksichtigt, da bei sehr kleinen Intensitäten Artefakte das Ergebnis verfälschen können.
Von den insgesamt 23643 analysierten Genen wurden mit Hilfe des „t-Tests“ 664 Gene mit einem p-Wert </= 5x10 -3 gefunden. Das heißt, es wurden 664 Gene gefunden, deren Expression durch eine Bestrahlung von 10 Gy statistisch signifikant verändert wurde. Die Wahrscheinlichkeit eines falschen Ergebnisses beträgt für jedes dieser Gene weniger als 0,5%. Bei 343 Genen war die Expression nach Bestrahlung verstärkt, bei 321 Genen war die Expression geringer nach Bestrahlung. Durch die Bestrahlung wurden demnach ungefähr
gleich viele Gene hoch- wie herunterreguliert. Eine Beurteilung dieses Ergebnisses wird erst durch die Kenntnis der Funktionen der regulierten Gene möglich.
Abb. 22: Die Abbildung zeigt Gene mesenchymaler Stammzellen mit signifikant veränderter Expression (p-Wert </= 1x10-3) 6 Stunden nach Bestrahlung mit 10 Gy. Die Regulation, d.h.
die Expressionsintensität von bestrahlten Zellen im Verhältnis zu nicht bestrahlten Kontrollzellen (log2) der Gene ist als log2 (Verhältnis) dargestellt. Nach der Bestrahlung hochregulierte Gene sind rot, herunter regulierte Gene grün. Bei allen 6 Versuchen war die Expression dieser Gene nach der Bestrahlung einheitlich hoch- bzw. herunterreguliert.
Ergebnisse 66
Die Einteilung dieser Gene in Gruppen nach ihrer biologischen Funktion erfolgte mit Hilfe der „ Gene Ontology Database“. Um zunächst eine erste Übersicht zu bekommen, wurden die regulierten Gene nach ihren Funktionen in größere Gruppen zusammengefasst (Tab.2). In dieser Tabelle sind nur Gruppen, die mindestens 10 Gene enthalten, aufgeführt. Es waren Gene reguliert, die direkt mit einer Schädigung durch die Bestrahlung in Verbindung gebracht werden können. Dies betrifft Gene, die Zelltod, Stressantwort, Zellzyklus und Proliferation regulieren. Es waren aber auch sehr viele weitere Gene reguliert. Viele dieser Gene haben eine Funktion in der Genexpression, metabolischen Prozessen und der biologischen Regulierung. Unter den Genen, die in Zusammenhang mit dem Metabolismus stehen, waren sowohl Gene, die in Zusammenhang mit katabolen Prozessen und Proteolyse stehen, als auch Gene, die an der Biosynthese beteiligt sind. Auch viele Gene des RNA- und DNA – Metabolismus wurden reguliert. Weiterhin wurden mehrere Gene reguliert, die an Transport, Signaltransduktion, Organellenorganisation, Adhäsion und Motilität beteiligt sind. Dies macht deutlich, dass die Bestrahlung Auswirkungen auf die gesamte Stoffwechsellage der Zelle hat.
Zudem waren interessanterweise auch viele Gene reguliert, die eine Rolle bei der Zelldifferenzierung und Entwicklung spielen.
GO- terms (biological process) Anzahl GO- terms (biological process) Anzahl
nur übergeordnete Gruppen der Gene nur übergeordnete Gruppen der Gene
gene expression 105 developmental process 62
transcription 81 cell differentiation 40
system process 22
metabolic process 241
RNA metabolic propocess 99 localization 60
DNA metabolic process 27 transport 45
protein metabolic process 90
lipd metabolic process 22 signal transduction 79
macromolecule metabolic process 19
proteolysis 16 organelle organisation and biogenesis 31
catabolic process 24
biosynthetic process 40 biological adhesion 15
generation of precoursor metabolites 10 cell motility 15
biological regulation 142 cell death 27
positive regulation of biological process 29 response to stress 41
negative regulation of biological process 44 cell cycle 24
cell proliferation 18
Tab. 2: In der Tabelle sind die nach Bestrahlung mit 10 Gy signifikant regulierten Gene (p< 5x10 -3) nach ihrer biologischen Funktion in Gruppen eigeordnet. Die Einteilung erfolgte mit Hilfe der „Gene Ontology Database“. Dargestellt sind nur Gruppen mit mindestens 10 Genen.
Desweiteren wurden Gen-Gruppen identifiziert mit verhältnismäßig vielen regulierten Genen, gemessen an der Gesamtzahl der Gene (p < 0,05). Berücksichtigt wurden hier nur Gruppen mit mindestens 5 und höchstens 50 Genen (Tab. 3). Hier wurden signifikant regulierte Gengruppen gefunden, die allgemein eine Rolle bei der Stressantwort spielen und Gene, die spezifisch an der Reaktion von Zellen auf die DNA- Schädigung beteiligt sind, wie z.B. Gene, die Apoptose und DNA-Reparatur regulieren oder Gene, die den Zellzyklus kontrollieren. In Tabelle 4 sind diese einzeln aufgelistet. Überrepräsentiert waren außerdem viele Gene, die metabolische und andere biologische Prozesse negativ regulieren und Gene die mit dem zellulären Katabolismus in Zusammenhang stehen. Weitere Gengruppen sind in der Tabelle aufgelistet.
GO-Terms (biological process), Sel: 5-50, P-Sel <0,05 Anzahl der Gene
apoptosis 26
regulation of programmed cell death/ apoptosis 21
DNA metabolic process 27
DNA repair 15
negative regulation of cell cycle 11
cell cycle checkpoint 5
response to stress 41
response to endogenous stimulus 21
response to DNA damage stimulus 17
response to hypoxia 5
regulation of cell migration/ cell motility/locomotion 5
lipid biosynthetic process 12
cofactor biosynthetic process 5
positive regulation of biosynthetic process 5
negative regulation of biological process 44
negative regulation of metabolic process/ cellular metabolic process 16 negative regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolic process 15
cellular catabolic process 23
peptidyl-amino acid modification 8
negative regulation of transcription 13
phosphorylation 28
protein amino acid phosphorylation 25
secretion by cell 11
secretory pathway 10
exocytosis 6
small GTPase mediated signal transduction 18
transition metal ion transport 5
Tab. 3: In der Tabelle sind Gen-Gruppen mit mindestens 5 und höchstens 50 nach Bestrahlung mit 10 Gy signifikant regulierten Gene (p< 5 x10 -3). Hier sind nur Gruppen mit verhältnismäßig vielen regulierten Genen, gemessen an der Gesamtzahl der zu der Gruppe gehörenden Gene (p < 0,05), abgebildet. Mit gleichen Farben sind funktional ähnliche Gruppen dargestellt.
Ergebnisse 68
Response to DNA damage stimulus
DNA repair SETX, DCLRE1C, REV3L, FANCC, EPC2, RAD23B, ASTE1, ATM, POLG/ APEX1, TDP1, RAD50, CSNK1D, PMS2L5
DNA damage checkpoint -/PML, NEK11 Apoptosis
Negative regulation of apoptosis GSK3B,SELS /ANGPTL4, NOTCH2, PSEN1, HDAC1, NFKB1, AATF, IER3, RTN4
Positive regulation of apoptosis SETX, ADAMTSL4, F2R, PLAGL1/ IGFBP3, STAT1, DNAJB6, NOTCH2, PML, TPD52L1, MAPK1
Neuron apoptosis -/UNQ188
Cell cycle
Cell cycle CARR1/ TPD52L1, RAD50, MAPK1, NEK11, TUSC4
Cell cycle arrest PLAGL1/ NOTCH2, RASSF1, RB1
Negative regulation of cell cycle ATM, BTG/TUSC4, RECK, NF2, DLG1
Cell cycle checkpoint ATM/ RB1, PML
Negative regulation of cell proliferation
FABP3, TSC1, MDM4, SCYE1, BTG3/ NF2,NOTCH2, FTH1
Tab. 4: In der Tabelle sind nach der Bestrahlung mit 10 Gy signifikant regulierte Gene (p < 5x10-3) abgebildet, die an der Reaktion von Zellen auf eine DNA- Schädigung beteiligt sind. Gene vor den Schrägstrich sind hochreguliert, die Gene danach herunterreguliert.
Wie oben bereits erwähnt, wurde durch die Bestrahlung auch die Expression verschiedener Gene, die an der Differenzierung und Entwicklung beteiligt sind beeinflusst (Tab.5). Wie zu erwarten waren zum Einen Gene reguliert, die in Zusammenhang mit den typischen Entwicklungsrichtungen mesenchymaler Stammzellen stehen. Hierzu gehören das Skelett und das Muskelgewebe. Zum Anderen waren aber auch Gene reguliert, die an der Entwicklung anderer Gewebe beteiligt sind, z.B. des Nervensystems und der Haut. Auffallend waren weiterhin die vielen an der Angiogenese beteiligten Gene, die ausschließlich herunterreguliert waren. Zu den regulierten Genen gehörten auch je ein Markergene der adipogenen und osteogenen Differenzierung, PPARG und BMP6.
Development and differentiation CSH1/PPARG, FZD2, NOTCH2, SH3BP4 Skeletal development BMP6, ORS2, UFD1L/ VDR
Nervous system development NTRK2,TSC1, ID4/ NOTCH2, SOX11, RTN4, NF2, BAI2 Muscle development TSC1/ DMD, ITGA11, IGFBP3, RB1
Heart development TSC1/ EGLN1, CHD7, Kidney development TSC1/ C1GALT1, ASL
Skin development KRT9/-
Mesoderm development JAK3/-
Blood vessel development -/ C1GALT1, CHD7, ANGPTL4, ARHGAP24, PML, SERPINE1, MYH9 Tab. 5: In der Tabelle sind nach der Bestrahlung mit 10 Gy signifikant regulierte Gene (p < 5x10-3) abgebildet, die an Zelldifferenzierung und Entwicklung beteiligt sind. Gene vor den Schrägstrich sind hochregulierten, die Gene danach herunterreguliert.
Eine Tabelle mit allen nach einer Bestrahlung mit 10 Gy signifikant regulierten Genen (p <
5x10 -3), deren Funktion bekannt ist, befindet sich im Anhang. Die Tabelle enthält auch die Regulierung und eine Beschreibung der Funktion der einzelnen Gene.
4.7.2. Expression von MSC- Markern, embryonalen Stammzellmarkern,