Regulation der XT durch miRNAs

80 jedoch auch eine verstärkte Matrixsynthese nach Inkubation von Fibroblasten mit Endothelin-1 beschrieben, sodass keine definitive Einordnung des fibrotischen Potenzials dieses Induktors vorgenommen werden kann (Shi-Wen et al. 2007b). Bezüglich der Regulation der XT-I scheint Endothelin-1 einen zu vernachlässigenden Einfluss auszuüben.

Die XYLT2 mRNA Expression wurde durch keinen der supplementierten Faktoren signifikant beeinflusst. Diese Beobachtung festigt die postulierte, untergeordnete Rolle der XT-II in der Fibrosierung.

81 Tabelle 4.1: Auflistung der Kriterien der angewandten target prediction tools. Modifiziert nach Sethupathy et al.

2006.

TargetScan Human DIANA mT Pic Tar Bindung mRNA/miRNA

Perfekte seed-Paarung X

Präferenz: perfekte seed-Paarung X

Empirische Bindung X

Thermodynamik: ΔG-Berechnung

RNA-Faltung X X

Nukleinsäure-Hybridisierung X

Konservierung

Mensch/Maus X

Mensch/Schimpanse/Nager/Hund X X

Um zu prüfen, ob die in silico determinierten miRNAs auch in vitro eine Effektivität aufweisen, erfolgte deren Transfektion in dermale Fibroblasten. Aufgrund des experimentellen Ablaufs einer reversen Transfektion, welcher vorsieht, dass die Transfektion der Zellen direkt nach dem Aussäen erfolgt, wurde kein Serumentzug durchgeführt. Eine Anheftung der Zellen an die Kulturschale ist aufgrund des Mangels an Fibronektin und Vitronektin unter Serumentzug nicht möglich (Hayman et al. 1985). Des Weiteren wurde die Zelldichte bedingt durch eine putative Reduktion der Zellzahl durch die Transfektion von 40 auf 45 Zellen/mm² leicht erhöht, wobei bei dieser Zelldichte weiterhin eine starke Myofibroblasten-Differenzierung gewährleistet ist.

Die Behandlung der Zellen mit miR-18a bzw. miR-34a zeigte nach 48stündiger und 72stündiger Inkubation eine signifikante Reduktion der XYLT2 bzw. XYLT1 mRNA Expression auf (s. Abb. 3.21). miR-18a verursachte ergänzend eine erwartete, nicht-signifikante Reduktion der XYLT1 mRNA Expression. Demnach konnte eine zu der in silico Analyse korrelierende, spezifische Bindung der miRNAs erfolgreich nachgewiesen werden.

Analog zu der Reduktion der XYLT mRNA Expression erfolgte auch eine Absenkung der XT-Aktivität (s. Abb. 3.22). Diese konnte jedoch erst nach 144stündiger Inkubation beobachtet werden, was auf eine Translations-basierte Verzögerung hinweist. Eine Behandlung der dermalen Fibroblasten mit den miRNA-Inhibitoren der miR-18a bzw. miR-34a resultierte in nur marginalen Änderungen der XYLT Genexpression (s. Abb. 3.24). Die im

82 Zellkulturüberstand quantifizierte XT-Aktivität wurde nach 144 h signifikant induziert (s.

Abb. 3.25).

Zusammenfassend kann den miRNAs miR-18a und miR-34a demnach eine XYLT Expression-regulierende Eigenschaft zugesprochen werden, wenngleich deren funktionale Auswirkung auf die Proteinexpression relativ gering war. Dieser Effekt lässt sich einerseits darauf zurückführen, dass die relative Quantifizierung der mRNA Expression spezifisch für eine XT-Isoform ist, während eine spezifische Determinierung der XT-Aktivität einer XT-Isoform bisher nicht möglich ist, sodass eine Hintergrundaktivität durch die jeweils nicht supprimierte Isoform verursacht wird. Andererseits demonstrierten Selbach et al. 2008, dass die Auswirkungen einer miRNA-Transfektion oder eines endogenen miRNA-Knockdowns auf die Proteinexpression typischerweise nur sehr schwach sind (Selbach et al. 2008).

Über einen miRNA Genexpressions-Array wurde weiterführend evaluiert, ob die miR-18a und miR-34a in der Fibrose einen regulatorischen Einfluss auf die XT nehmen. Der Vergleich des miRNA Genexpressionsprofils unbehandelter und mit TGF-β1 induzierter dermaler Myofibroblasten ergab, dass eine starke Regulation der Fibrose-assoziierten miRNAs miR-21 und miR-29b und nur eine moderate Regulation der miR-18a und -34a erfolgte (s. Abb. 3.23).

Die verzeichnete Induktion der miR-21 sowie die Repression der miR-29b steht im Einklang mit einer verstärkten bzw. verminderten Expression dieser im fibrotischen Kontext und verifiziert somit das experimentelle Modell. Thum et al. zeigten 2008, dass eine Induktion der Expression der miR-21 mit einer ventrikulären Fibrose bei Herzinsuffizienz assoziiert werden kann. In einem Mausmodell kardialer Hypertrophie konnte ergänzend eine Aufhebung interstitieller Fibrosen über einen miR-21 Inhibitor vorgenommen werden (Thum et al. 2008).

Die miR-21 fördert das TGF-β1-Signaling in Fibrosen durch Repression von SMAD7, einem inhibitorisch wirksamen Transkriptionsfaktor der TGF-β1-Signalkette (Patel und Noureddine 2012). Die Zielgene der miR-29b umfassen ECM-Komponenten wie Kollagene, Elastine oder fibrillenbildende Proteine. Eine TGF-β1 induzierte Expressionsverringerung der miR-29b trägt entscheidend zur Fibrosierung bei. Eine Absenkung der fibrotisch präventiv wirkenden miR-29b Expression konnte in Lungenfibroblasten von Patienten mit idiopathisch pulmonarer Fibrose, in dermalen Fibroblasten von Sklerodermie-Patienten sowie in einem Mausmodell renaler Fibrose nachgewiesen werden (Maurer et al. 2010; Pandit et al. 2011; Qin et al. 2011).

Die im Genexpressions-Array detektierte, moderate Regulation der miR-18a und -34a lässt keine eindeutigen Schlüsse zu. Einerseits besteht die Möglichkeit, dass die XT in der

83 Fibrosierung nur marginal durch miRNAs reguliert werden. Diesbezüglich muss nachfolgend evaluiert werden, ob die untersuchten miRNAs einer Regulation in der Myofibroblasten-Differenzierung unterliegen. Ein Taqman-Sonden-basierter Nachweis der spezifischen miRNAs könnte hier Aufschluss geben. Andererseits ist auch denkbar, dass die XT in vivo durch die miR-18a und -34a primär in alternativen Stoffwechselvorgängen reguliert werden.

Gestützt wird diese Hypothese durch zahlreiche Publikationen, die belegen, dass die miR-18a und -34a Mediatoren der Tumorgenese sind. Während miR-34a eine verringerte Expression in Tumorgewebe aufzeigt und ein Mediator der Tumor-Suppressorfunktion von p53 ist, besitzt die miR-18a eine onkogene Wirkung und wird in Tumorgewebe verstärkt exprimiert (Olive et al. 2010; Bader 2012). Obwohl es auch Hinweise auf eine Regulation von CTGF durch die miR-18a gibt und eine miR-34a Inhibition unter anderem als Fibrose-reduzierend beschrieben wird, scheint eine vorherrschende Regulation der XT in der Fibrogenese durch die miRNA-18a und -34a unwahrscheinlich (van Almen et al. 2011; Boon et al. 2013).

Weiterführend sollte dennoch überprüft werden, ob Fibrose-assoziierte miRNAs wie miR-21 oder -29b möglicherweise auch Einfluss auf die XT nehmen. Obwohl diese entsprechend einer in silico Analyse (Daten nicht gezeigt) keine primären Zielgene der miR-21 und -29b sind, ist eine sekundäre Regulation über einen Mediator durchaus in Betracht zu ziehen.

Zusammengefasst konnte über die Untersuchung der XT-Regulation durch profibrotische Mediatoren erstmalig gezeigt werden, dass die XYLT1 mRNA Expression sowie die XT-Aktivität geeignete Biomarker für die Myofibroblasten-Differenzierung darstellen und sich als Target einer antifibrotischen Therapie eignen könnten. Die postulierte Funktion von TGF-β1 als Schlüsselmediator der XT-Regulation in der Fibrose konnte bekräftigt werden. Ergänzend ergaben sich Hinweise darauf, dass auch Activin A ein wichtiger Mediator der XT ist. Eine alleinständige Beeinflussung der XYLT Expression konnte weder für CTGF noch für PDGF, Angiotensin-II oder Endothelin-1 herausgestellt werden. Hingegen scheinen diese Faktoren die Wirkung von TGF-β1 in der Fibrosierung durch Interaktionen zu modulieren. Darüber hinaus konnte erstmals eine Regulation der XT durch miRNAs demonstriert werden. Ob die miRNAs miR-18a und -34a in der Fibrosierung oder vornehmlich in anderweitigen physiologischen Prozessen Einfluss auf die XT nehmen, muss weiterführend eruiert werden.

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