5. Ergebnisse
5.1. miR-451 während der Hämatopoese
5.1.4. Regulation der Expression des miR-144/451 Clusters durch hämatopoetische
Zu den wichtigen hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren, die an der megakaryozytären bzw. erythroiden Differenzierung beteiligt sind, zählen neben RUNX1 ebenso GATA1 sowie Tal1. In vorherigen Arbeiten im Labor konnte gezeigt werden, dass RUNX1 zusammen mit Tal1 ein entscheidender Regulator der Differenzierung von megakaryozytären-erythroiden Vorläuferzellen (MEPs) darstellt [207]. Darauf beziehend wurde nachfolgend untersucht, ob neben RUNX1 auch Tal1 und GATA1 einen Einfluss auf die Expression der miRNAs miR-144 und miR-451 ausüben.
Kontrolle
miR-144 wt/ miR-451 wt
miR-144 mut/ miR-451 mut
miR-144 wt/ miR-451 mut
miR-144 mut/ miR-451 wt 0
5 10 15 20 25
Anzahl erythroider Kolonien [%]
Kontrolle
Tal1 0
10 20 30 40
Anzahl erythroider Kolonien [%]
A B
Eine Überexpression des megakaryozytären Transkriptionsfaktors RUNX1 in K562 Zellen führte zu einer Herunterregulierung der miR-144/451 Expression (Abbildung 20 A-B) bzw.
Abbildung 11 für die reife miR-144 und miR-451. Außerdem wurde, wie in Kuvardina et al.
[207] beschrieben, die Expression des erythroiden Markerproteins Glykophorin A deutlich reduziert (Abbildung 20 C).
Kontrolle K562-RUNX1 0
250 500 750 1000 1250
relative RUNX1 Expression
Kontrolle K562-RUNX1 0.0
0.5 1.0 1.5
relative miR-144/451 Expression
Ko
ntrolle K562-RUNX1 0.0
0.5 1.0 1.5
relative GYPA Expression
Abbildung 20: Überexpression von RUNX1 reprimiert die Expression des miR-144/451 Clusters sowie von Glykophorin A in K562 Zellen.
K562 Zellen wurden lentiviral mit dem RUNX1-Überexpressionsvektor transduziert und die Expression mittels qRT-PCR bestimmt. (A) Kontrolle der Überexpression von RUNX1 in transduzierten K562 Zellen. (B) Die Überexpression von RUNX1 reprimiert die Expression des miR-144/451 Clusters. (C) Die Expression des erythroiden Gens Glykophorin A (GYPA) ist erheblich herunterreguliert bei Überexpression von RUNX1. Aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei unabhängigen Werten wurde die Standartabweichung ermittelt und als Fehlerbalken dargestellt.
Im Gegensatz dazu erhöhte eine Überexpression der Transkriptionsfaktoren Tal1 und GATA1, die essentiell sind für die erythroide Differenzierung, in K562 Zellen die miR-144/451 Expression. Während bei der Tal1-Überexpression die Expression des Clusters der miR-144/451 (Abbildung 21 A-B) leicht erhöht ist, verstärkt die Überexpression von GATA1 die Expression der miR-144/451 erheblich (Abbildung 21 E-F). Die Überexpression von Tal1 führte ebenfalls zu einer gesteigerten Expression des beschriebenen erythroiden Zielgens Glykophorin A, die sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf der Zelloberfläche mittels FACS nachgewiesen werden konnte (Abbildung 21 C-D).
A B C
Kontrolle K562
-Tal1 0
10 20 30
relative Tal1 Expression
Kontrolle K562
-Tal1 0.0
0.5 1.0 1.5
relative miR-144/451 Expression
Kontrolle K562
-Tal1 0.0
0.5 1.0 1.5
relative GYPA Expression
Kontrolle K562
-Tal1 0
20 40 60 80 100
GYPA positive Zellen [%]
Kontrolle K562-GATA1 0
10 20 30 40 50 60 70
relative GATA1 Expression
Kontrolle K562-GATA1 0
1 2 3 4 5
relative miR-144/451 Expression
Abbildung 21: Überexpression von Tal1 und GATA1 erhöht die Expression des miR-144/451 Clusters und von Glykophorin A in K562 Zellen.
K562 Zellen wurden lentiviral mit Tal1- bzw. GATA1-Überexpressionsvektoren transduziert und die Expression mittels qRT-PCR nachgewiesen. (A) Kontrolle der Überexpression von Tal1 in transduzierten K562 Zellen. (B) Die Überexpression von Tal1 erhöht die Expression des miR-144/451 Clusters. (C) Die Expression des erythroiden Gens Glykophorin A (GYPA) ist heraufreguliert bei Überexpression von Tal1. (D) Die Überexpression von Tal1 erhöht die Anzahl an GYPA positiven K562 Zellen. (E) Kontrolle der Überexpression von GATA1 in transduzierten K562 Zellen. (F) Die Überexpression von GATA1 erhöht erheblich die Expression des miR-144/451 Clusters. Aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei unabhängigen Werten wurde die Standartabweichung ermittelt und als Fehlerbalken dargestellt.
In den nachfolgenden Knockdown-Studien sollten diese Ergebnisse bestätigt werden. Hierfür wurden K562 Zellen mit jeweils zwei verschiedenen shRNAs gerichtet gegen RUNX1, Tal1 sowie GATA1 transduziert. Für diesen Versuch wurden die zwei shRNA Konstrukte verwendet, die im Westernblot nachweislich die Proteinexpression am deutlichsten reprimierten [208].
Mittels qRT-PCR wurde anschließend die Effizienz der Herunterregulation des betreffenden Transkriptionsfaktors bestimmt sowie die Expression der reifen 451 bzw. des miR-144/451 Clusters. Der Knockdown von RUNX1 war erfolgreich und reduzierte die RUNX1 Expression auf etwa 50 % und führte zu einer verstärkten Expression des miR-144/451 Clusters (Abbildung 22 A-B).
A B C D
E F
Kontrolle K562
-shRUNX1 #1 K562
-shRUNX1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative RUNX1 Expression
Kontrolle K562
-shRUNX1 #1 K562
-shRUNX1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
relative miR-144/451 Expression
Abbildung 22: Knockdown von RUNX1 erhöht die Expression des miR-144/451 Clusters in K562 Zellen.
K562 Zellen wurden lentiviral mit zwei verschiedenen RUNX1-Knockdown-Konstrukten transduziert und die Expression mittels qRT-PCR bestimmt. (A) Nach Knockdown von RUNX1 sinkt die Expression von RUNX1 in transduzierten K562 Zellen. (B) Der Knockdown von RUNX1 erhöht die Expression des miR-144/451 Clusters. Aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei unabhängigen Werten wurde die Standartabweichung ermittelt und als Fehlerbalken dargestellt.
Die Herunterregulation der Tal1- und GATA1-Expression konnte erfolgreich auf mRNA-Ebene gezeigt werden (Abbildung 23 A, E). Diese resultiert in einer ebenfalls verminderten Expression des miR-144/451 Clusters sowie des Glykophorin A (Abbildung 23 B-C, F-G).
Mittels FACS-Messung konnte bei den K562 Zellen, die die Knockdown-Konstrukte gegen Tal1 bzw. GATA1 exprimierten, eine verminderte Oberflächenexpression des erythroiden Markerproteins CD71 festgestellt werden (Abbildung 23 D, H). Die Ergebnisse der Knockdown-Experimente bestätigen die Resultate der Überexpressionsexperimente, da sie sich, wie erwartet, gegensätzlich verhalten.
Kontrolle K562
-shTal1 #1 K562
-shTal1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative Tal1 Expression
Kontrolle K562
-shTal1 #1 K562
-shTal1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative miR-144/451 Expression
Kontrolle K562
-shTal1 #1 K562
-shTal1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative GYPA Expression
Kontrolle K562
-shTal1 #1 K562
-shTal1 #2 0
5000 10000 15000 20000 25000 30000
CD71 mittlere Fluoreszenzintensität
A B
B
A C D
Kontrolle K562
-shGATA1 #1 K562
-shGATA1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative GATA1 Expression
Kontrolle K562
-shGATA1 #1 K562
-shGATA1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative miR-144/451 Expression
Kontrolle K562
-shGATA1 #1 K562
-shGATA1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative GYPA Expression
Kontrolle K562
-shGATA1 #1 K562
-shGATA1 #2 0
5000 10000 15000 20000
CD71 mittlere Fluoreszenzintensität
Abbildung 23: Knockdown von Tal1 und GATA1 reprimiert die Expression des miR-144/451 Clusters sowie die Expression der erythroiden Gene GYPA und CD71 in K562 Zellen.
K562 Zellen wurden lentiviral mit zwei verschiedenen Tal1 bzw. GATA1 Knockdown-Konstrukten transduziert und die Expression mittels qRT-PCR bestimmt. (A) Nach Knockdown von Tal1 sinkt die Expression von Tal1 in transduzierten K562 Zellen. (B) Der Knockdown von Tal1 reprimiert die Expression des miR-144/451 Clusters. (C) Die Expression von Glykophorin A ist vermindert beim Knockdown von Tal1. (D) Der Knockdown von Tal1 für zu einer reduzierten Okkupation von CD71 auf der Zelloberfläche von transduzierten K562 Zellen. Diese konnte mittels FACS nachgewiesen werden. (E) Nach Knockdown von GATA1 sinkt die Expression von GATA1 in transduzierten K562 Zellen. (F) Der Knockdown von GATA1 führt zu einer reprimierten Expression des miR-144/451 Clusters. (G) Die Expression von Glykophorin A ist vermindert nach GATA1 Knockdown. (H) Mittels FACS konnte eine reduzierte Okkupation von CD71 auf der Zelloberfläche von transduzierten K562 Zellen nach Knockdown von GATA1 nachgewiesen werden. Aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei unabhängigen Werten wurde die Standartabweichung ermittelt und als Fehlerbalken dargestellt.
Die veränderte Expression des miR-144/451 Clusters nach Knockdown der Transkriptionsfaktoren RUNX1, Tal1 und GATA1 konnte ebenfalls für die reife, prozessierte miR-451 gezeigt werden (Abbildung 24 A-C). Während die verminderte Expression von RUNX1 zu einer leichten Erhöhung der reifen miR-451 führte, reduzierte die herabgesetzte Expression von Tal1 und GATA1 den Anteil der reifen miR-451 im Vergleich zur Kontrolle.
Kontrolle K562
-shRUNX1 #1 K562
-shRUNX1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative miR-451 Expression
Kontrolle K562
-shTal1 #1 K562
-shTal1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative miR-451 Expression
Kontrolle K562
-shGATA1 #1 K562
-shGATA1 #2 0.0
0.5 1.0 1.5
relative miR-451 Expression
Abbildung 24: Knockdown von RUNX1 erhöht die Expression der miR-451, während der Knockdown von Tal1 und GATA1 die Expression der miR-451 reprimiert in K562 Zellen.
K562 Zellen wurden lentiviral mit zwei verschiedenen RUNX1, Tal1 bzw. GATA1 Knockdown-Konstrukten transduziert und die Expression der miR-451 mittels des miscript-Systems in qRT-PCR bestimmt. (A) Knockdown
E F G H
A B C
von RUNX1 führt zu einer leichten Erhöhung der reifen miR-451 in transduzierten K562 Zellen. (B) Der Knockdown von Tal1 senkt den Gehalt an der reifen miR-451. (C) Die Anwesenheit der reifen miR-451 ist vermindert beim Knockdown von GATA1. Aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils drei unabhängigen Werten wurde die Standartabweichung ermittelt und als Fehlerbalken dargestellt.