Die Spaltung von Disulfidbrücken kann einerseits durch Oxidation erfolgen, wobei die Disulfidbrücke durch Perameisensäure zu Cysteinsäuren oxidiert wird. Andererseits können die Disulfidbrücken auch durch Verwendung mit reduzierenden Agenzien, wie 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT, Cleland's Reagens) oder Tributylphosphin reduziert werden. Letzteres wird beim Edman-Abbau eingesetzt, da es leicht flüchtig ist. DTT besitzt ein niedriges Redoxpotential und kann deshalb in kurzer Zeit Disulfidbrücken spalten. Um eine Reoxidation der Cysteinreste zu verhindern, werden alkylierende Reagenzien, z.B. Iodacetamid eingesetzt, das die freien Thiol-gruppen (SH-Gruppen) modifiziert. Die nachfolgende Abb. 3.18 zeigt beispielhaft die Reduktion einer Disulfidbrücke und anschließend die Modifizierung der SH-Gruppen mit Iodacetamid:
HS 2
Iodacetamid S-(Carboxymethyl)cystein Abb. 3.18: Reduktion der Disulfidbrücke.
3.8.1 Sind die Proteine DsrE, DsrF und DsrH über intermolekulare Disulfidbrücken verbunden?
Die Identifizierung intermolekularer Disulfidbrücken ist wichtig, um eine Aussage über die Struktur der Untereinheiten eines nativen Proteins zu machen! Um festzustellen, ob die Proteine DsrE, DsrF und DsrH über intermolekulare Disulfidbrücken verbunden sind, wurde das aufgereinigte rekombinante DsrEFH-Protein in Gegenwart reduzierender und nicht reduzierender Agenzien denaturiert. Hierbei muss beachtet werden, dass unter nicht reduzierenden, jedoch denaturierenden Bedingungen artifizielle Disulfidbrücken durch freie Cysteinreste hervorgerufen werden können, die sonst in dem nativen Protein nicht auftreten (Kumar und Davidson, 1990).
Eine aufgereinigte DsrEFH-Proteinprobe wurde einmal mit reduzierendem Puffer Roti-Load 1 (enthält 2-Mercaptoethanol) und einmal mit nicht reduzierendem Puffer Roti-Load 2, jeweils in
P -S-S- P
+ OH
P
P -SH +
P
HO OH
S-S
-SH + I-CH2-C-NH2
O
-S-CH2-C-NH2
2-Mercaptoethanol O
einem Verhältnis 1:4 verdünnt, versetzt. Außerdem wurde eine Probe des aufgereinigten DsrEFH- Proteins mit 10 mM Iodacetamid und mit 2 x SDS-Puffer in einem Verhältnis 1:4 verdünnt, versetzt und für 2 Stunden auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben in einer SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Proben wurden vor dem Auftrag auf das SDS-Gel noch für 5 min bei 100°C aufgekocht. Das Ergebnis dieses Inkubationsexperiments von DsrEFH mit und ohne reduzierenden Agenzien und Iodacetamid zeigt die Abb. 3.19. Wird DsrEFH mit 2-Mercapto-ethanol reduziert und anschließend aufgekocht, so lässt sich im Proteingel nur das DsrEFH- Proteintrimer beobachten, d.h. es sind nur jeweils eine Proteinbande für DsrE, eine für DsrF und eine für DsrH im Gel zu erkennen. Wird DsrEFH mit nicht reduzierendem Puffer inkubiert und aufgekocht, so lassen sich im Gel noch zusätzliche Proteinbanden beobachten. Die Probe, die mit Iodacetamid versetzt wurde, zeigte nach dem Aufkochen keine zusätzlichen Proteinbanden. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Proteine DsrE, DsrF und DsrH untereinander nicht über eine intermolekulare Disulfidbrücke verbunden sind. Nicht reduzierende und denaturierende Bedingungen (Spur 2: DsrEFH ohne 2-Mercaptoethanol versetzt) haben vermutlich hier eine artifizielle Disulfidbrücke hervorgerufen.
Abb. 3.19: SDS-Proteingel (15 %) zum Nachweis, dass die Proteine DsrE, DsrF und DsrH nicht über eine intermolekulare Disulfidbrücke verbunden sind. Die Proben wurden 5 min bei 100°C aufgekocht. Jeweils 20 µl von den Proben wurden aufgetragen.
Bestätigt wurde die Bildung artifizieller Disulfidbrücken zwischen den drei Polypeptiden, indem die Probe aus Spur 2 anschließend noch geblottet wurde, siehe Abb. 3.20.
M
70 45 35 25 15
10
DsrEFH 2-Mercapto
-ethanol
DsrEFH nicht reduzierend
DsrEFH mit Iodacetamid
55
DsrF DsrE DsrH
Abb. 3.20: Western-Blot zum Nachweis der artifiziellen Disulfidbrücken. Der DsrF- und DsrH- Antikörper wurden für den Nachweis 1:5000 verdünnt eingesetzt. Der Nachweis erfolgte mit Hilfe des ECL-Western-Blot Detektionssystems (Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg).
Für den Nachweis von DsrE wurde das DsrE-Antiserum 1: 2000 verdünnt eingesetzt. Die Detektion von DsrE erfolgte nach der konventionellen Methode (mit 4-Chloro 1-Naphthol).
DsrE zeigte zwei starke Signale (Spur 2). Ein Signal erscheint in der Höhe von 14,6 kDa, das der Größe des DsrE-Polypeptids entspricht. Ein zweites Signal erscheint in der Höhe von ca. 29 kDa.
Dieses Signal deutet auf ein artifiziell gebildetes DsrE-Dimer hin. DsrH (Spur 3) zeigt ein Signal in der Höhe von 10,9 kDa, entsprechend der Größe des DsrH-Polypeptids. Weitere Signale lassen sich in Höhe von DsrE bei 14,6 kDa erkennen. Oberhalb von 15 kDa, bei ca. 23 kDa ist ein zweites schwaches Signal zu erkennen. Dieses Signal deutet auf ein artifiziell gebildetes DsrH-Dimer hin.
Drei Signale lassen sich oberhalb von 25 kDa beobachten. Diese Signale deuten auf artifiziell gebildete DsrEF-, DsrEE- bzw. DsrEH-Dimere hin, siehe auch in Spur 1. DsrF (Spur 1) zeigt ein Signal in der Höhe von 15,4 kDa, das der Größe des DsrF-Polypeptids entspricht. Weitere Signale sind zu erkennen in Höhe von ca. 34 kDa ein relativ starkes Signal, das auf ein artifiziell gebildetes DsrEF-Dimer hindeutete. Ein schwaches zweites Signal für DsrE liegt in Höhe von ca. 28 kDa und ein starkes Signal für DsrE in Höhe von 14,6 kDa. Ein schwaches Signal ist zudem erkennbar in Höhe von ca. 26 kDa, das auf ein artifiziell gebildetes DsrEH-Dimer hindeutet. Diese zusätzlichen Signale lassen sich in den Western-Blots nicht beobachten, wenn die DsrEFH-Probe unter reduzierenden oder alkylierenden Bedingungen aufgetrennt wurde. Die Disulfidbrücken in den DsrEF-, DsrEH- und DsrEE-Dimeren wurden demnach artifiziell hervorgerufen. Eine weitere
DsrH schwaches Signal bei ca. 23 kDa
DsrE 14,6. kDa DsrE stark bei ca. 29 kDa DsrE und DsrF
bei ca. 34 kDa DsrE schwach bei ca. 29 kDa DsrE u. DsrH schwach bei ca.
26 kDa
DsrH 10.9 kDa DsrF 15,4 kDa
DsrE 14,6. kDat k
Bestätigung dafür, dass DsrEFH nicht über kovalente Disulfidbrücken verbunden sind, lieferten auch die Ergebnisse der Massenbestimmung von DsrEFH mittels der ESI-MS-Analyse. Die drei Polypeptide wurden bei der ESI-MS-Analyse auseinandergerissen. Es wurde für jedes einzelne Protein die molekulare Masse bestimmt. Würden die drei Proteine DsrE, DsrF und DsrH über Disulfidbrücken untereinander zusammengehalten, so würden die kovalenten Verbindungen während der ESI-Messung nicht auseinandergerissen werden. Wahrscheinlich interagieren DsrE, DsrF und DsrH untereinander über hydrophobe Wechselwirkungen.