Rückstände von Tetracyclinen in Lebensmitteln

Nach Anwendung pharmakologisch wirksamer Substanzen beim Tier kann es in Abhängig-keit von der Pharmakokinetik der Substanzen und von den individuellen Wartezeiten zwi-schen letzter Anwendung und Fleischgewinnung zu Rückständen in geschlachteten Tieren kommen.

In der Richtlinie 81/852/EWG wurde eine Definition für Rückstände vorgenommen: „Rück-stände sind alle wirksamen Bestandteile oder deren Metabolite, die im Fleisch oder anderen Lebensmitteln enthalten sind, die von Tieren gewonnen wurden, denen das betreffende Arz-neimittel verabreicht wurde.“

2.1.7.1 Risikoabschätzung

Für die Anwendung bei lebensmittelliefernden Tieren wird ein Arzneimittel nur zugelassen, wenn

1. für den enthaltenen Wirkstoff ein MRL-Wert (maximum residue limit) festgelegt ist (gemäß Verordnung (EWG) Nr. 2377/90) und

2. das fertige Arzneimittel zusätzlich noch nach dem Arzneimittelrecht für die Anwen-dung bei lebensmittelliefernden Tieren zugelassen wird.

MRLs sind zugelassene Höchstmengen in verschiedenen Lebensmitteln tierischer Herkunft, die getrennt nach Tierarten und Geweben in vier Anhängen der Verordnung EWG 2377/90 (Verordnung des Rates zur Schaffung eines Gemeinschaftsverfahrens für die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückstände in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs) auf-gelistet werden. Die Europäische Gemeinschaft definiert in dieser Verordnung Höchstmengen als eine „Höchstkonzentration von Rückständen aus der Verwendung von Tierarzneimitteln, bei der die Gemeinschaft akzeptieren kann, dass sie legal zugelassen wird oder als eine in oder auf dem Nahrungsmittel annehmbare Konzentration anerkannt wird“.

Für die Festsetzung der MRLs müssen die pharmazeutischen Unternehmen bei der Europäi-schen Arzneimittelbehörde (EMEA – European Agency for the Evaluation of Medicinal Pro-ducts) bzw. dem Ausschuss für Tierarzneimittel (CVMP – Committee for Veterinary Medici-nal Products) die Untersuchungsergebnisse aus umfangreichen Unbedenklichkeitsversuchen zu dem betreffenden Arzneimittel vorlegen.

Im Rahmen dieser Unbedenklichkeitsversuche werden nach oraler Verabreichung des Arz-neimittels an Versuchstiere verschiedene toxikologische Parameter geprüft, zu denen unter anderem Toxizität, Reproduktionstoxizität, Mutagenität, Kanzerogenität und Immunotoxizität zählen. Bei Antibiotika sind außerdem Versuche zu den Auswirkungen auf die menschliche Darmflora zu prüfen (BETTE 1996).

Ermittelt wird in den toxikologischen Studien die Konzentration des Wirkstoffes, die im je-weiligen Versuch keine substanzspezifische Wirkung mehr hervorruft; diese Dosis wird als NOEL („no observed effect level“) bezeichnet. Zur Berechnung der annehmbaren Tagesdosis („acceptable daily intake (ADI)“), i.e die Rückstandsmenge, die der Verbraucher ohne er-kennbares gesundheitliches Risiko ein Leben lang täglich aufnehmen könnte, wird der NOEL des empfindlichsten Versuchs bei der empfindlichsten Tierart herangezogen. Statt des NOEL wird in mikrobiologischen Studien zu nachteiligen Effekten von antimikrobiellen Substanzen auf die humane Darmflora die MHK50 bestimmt; die MHK50 (MHK = minimale Hemmkon-zentration) ist die minimale Konzentration eines Arzneimittels, die das Wachstum von 50 % der Kulturen eines bestimmten Keimes hemmt (WHO 1998).

Bei der Berechnung des ADI-Wertes wird in Abhängigkeit von der Spezies, an der die Versu-che durchgeführt wurden, sowie von dem toxikologisVersu-chen Profil der Substanz ein SiVersu-cherheits- Sicherheits-faktor berücksichtigt (BETTE 1996).

Für die Festlegung der MRL-Werte für ein Arzneimittel werden von der EU definierte tägli-che Verzehrsmengen für Lebensmittel unterstellt, die in dem sogenannten statististägli-chen Wa-renkorb zusammengestellt sind: 300 g Muskulatur, 100 g Leber, 50 g Niere, 50 g Fett, 1,5 l Milch, 100 g Ei und 20 g Honig.

Zur Bewertung von Tetracyclin-Rückständen in Lebensmitteln liegen wissenschaftliche Be-richte vor, die unter anderem von verschiedenen Kommissionen der DFG (Deutsche For-schungsgemeinschaft) und von der gemeinsamen Expertenkommission der Welternährungs-organisation (FAO) und der WeltgesundheitsWelternährungs-organisation (WHO) (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives – JECFA) erarbeitet wurden. Dabei konzentrieren sich diese Berichte auf die Tetracyclin-Derivate, die zur Anwendung bei Tieren, die der Lebensmittel-gewinnung dienen, zugelassen sind (i.e. CTC, OTC, TC und DC). Die im Jahre 1990 durch das JECFA vorgelegte Risikoabschätzung für OTC bildete die Grundlage für die ersten euro-paweit gültigen MRLs für Tetracycline (WHO 1990). In Studien an freiwilligen Versuchsper-sonen sowie Versuchshunden wurde als wesentliche Wirkung von OTC die Induktion von Resistenzen bei Enterobacteriaceae beobachtet und dabei ein NOEL von 2 mg/Person/Tag festgestellt. Aufgrund dieses Wertes wurde von der JECFA unter Berücksichtigung eines Si-cherheitsfaktors von 10 ein ADI von 0-3 µg OTC/kg KGW empfohlen.

Eine Risikoabschätzung für TC und CTC folgte 1996 im 45. JECFA-Report; die Bewertung erfolgte auf Grundlage von Studien der antimikrobiellen Wirkung von TC und CTC auf hu-manpathogene Mikroorganismen sowie auf eine begrenzte Zahl von Keimen der normalen humanen Darmflora (WHO 1996). Die JECFA stufte die antimikrobielle Potenz der verschie-denen Tetracycline als vergleichbar ein und legte den 1990 bestimmten ADI-Wert für OTC als Gruppen-ADI für alle Tetracycline fest; außerdem wurde die Übernahme der MRL-Werte auch für TC und CTC empfohlen. Im gleichen Jahr wurde auch Doxycyclin hinsichtlich sei-ner Wirksamkeit auf die humane Darmflora überprüft und ebenfalls ein ADI-Wert von 0-3 µg/kg KGW bestimmt (CVMP 1996).

In einer weiteren Studie 1999 wurden einer kontinuierlichen E. coli-Kultur einem ADI-Wert von 25, 250 und 2500 µg/kg KGW äquivalente Konzentrationen von TC zugesetzt. Nur die höchste Konzentration führte zur Resistenzausbildung bei den untersuchten Keimen. Auf-grund dieser Studie wurde empfohlen, den Sicherheitsfaktor von 10 für die Berechnung des ADI-Wertes für Tetracycline zu streichen und statt dessen einen Gruppen-ADI-Wert von 0-30

µg/kg KGW festzulegen, was eine Verdopplung der aktuell geltenden MRLs bedeuten würde (WHO 1999). Eine rechtliche Umsetzung dieser Empfehlung ist noch nicht erfolgt.

2.1.7.2 Rechtliche Normen

In Deutschland bilden das Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz (LMBG) sowie das Arzneimittelrecht die Grundlage der amtlichen Untersuchungen auf Tetracyclin-Rückstände in Lebensmitteln. Die geltenden MRLs für Tetracycline, die in Anhang 1 der Verordnung EWG 2377/90 aufgelistet sind und auf dem aktuellen ADI-Wert von 0-3 µg/kg KGW basie-ren, sind in Tabelle 2 aufgeführt:

Tab. 2: MRL-Werte für Tetracycline in Lebensmitteln nach VO (EWG) 2377/90

Pharmakologisch Doxycyclin Doxycyclin Rinder: Nicht anwenden bei

Tieren, von denen Milch für den menschlichen Verzehr gewon-nen wird

Schweine

Geflügel: Nicht anwenden bei Tieren, von denen Eier für den menschlichen Verzehr

Die Überwachung von Lebensmitteln tierischer Herkunft auf Rückstände von gesundheitlich unerwünschten Stoffen erfolgt unter Berücksichtigung des Nationalen Rückstands-kontrollplanes, dessen Programm in der gesamten EU nach einheitlich festgelegten Maßstä-ben durchgeführt wird. Der Nationale Rückstandskontrollplan wird vom BVL (Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit) und den Behörden der Bundesländer jährlich neu erstellt und enthält für jedes Bundesland konkrete Vorgaben über die Anzahl der zu un-tersuchenden Tiere und tierischen Erzeugnisse, die zu unun-tersuchenden Stoffe, die anzuwen-dende Methodik sowie die Probenahme. Während jährlich ein bestimmtes Spektrum an Stof-fen vorgegeben wird, auf das die entnommenen Proben mindestens zu untersuchen sind (Pflichtstoffe), können die Bundesländer darüber hinaus bei einer definierten Anzahl von Tie-ren und Erzeugnissen die Stoffe nach aktuellen Erfordernissen und speziellen Gegebenheiten frei auswählen.

Zusätzliche Rückstandsuntersuchungen werden im Rahmen von betrieblichen Eigenkontrol-len und Qualitätssicherungssystemen durchgeführt, die teilweise auch rechtlich vorgeschrie-ben sind.

2.1.7.3 Einlagerung in Knochen

Eine Sonderrolle bei der Rückstandsanalytik nehmen die sogenannten gebundenen Rückstän-de ein, die von SMIT, HAAGSMA und RUITER (1999) als Verbindungen, die kovalent an Makromoleküle gebunden sind und nicht durch wässrige oder organische Lösungsmittel ext-rahiert werden können, definiert werden.

Erste Hinweise auf das Phänomen der Einlagerung von Tetracyclinen in Knochengewebe wurden bereits 1957 von MILCH et al. veröffentlicht. BUYSKE et al. (1960) beschrieben gebundene Rückstände von TC und CTC in Knochen von Tieren, die mit Tetracyclinen be-handelt wurden. Die Tetracycline, die aufgrund ihrer Struktur eine hohe Affinität zu metalli-schen Kationen aufweisen, bilden mit Calcium stabile Chelatkomplexe aus und werden auf diese Weise bevorzugt in die Mineralisierungszonen von knochenbildenden Geweben einge-lagert. Die Einlagerung erfolgt in Form von Tetracyclin-Calcium-Orthophosphat-Chelaten (BUYSKE et al. 1960; STAHLMANN u. LODE 2001), wobei die Affinität der Chelatbin-dung in der Reihenfolge OTC<TC<CTC zunimmt (OTTEN et al. 1975).

Die Menge der eingelagerten Chelate hängt nicht nur von der verabreichten Tetracyclindosis ab, sondern auch vom Zeitpunkt der Applikation im Hinblick auf das Knochenwachstum. Bei oraler Applikation einer identischen Dosis von Tetracyclinen erfolgt bei juvenilen Tieren, die sich im Stadium der intensiven Knochenmineralisierung befinden, die Einlagerung einer grö-ßeren Menge des Antibiotikums in die Knochen als bei adulten Tieren (BRÜGGEMANN et al. 1966). Wird die Applikation von Tetracyclinen beendet, sinkt der Gehalt der gebundenen Rückstände im Knochen zunächst deutlich, um dann über Wochen und Monate in noch nach-weisbaren Konzentrationen relativ konstant zu bleiben (BUYSKE et al. 1967).

Knochen, die gebundene Tetracyclin-Rückstände enthalten, zeigen eine Fluoreszenz unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 366 nm (BLOMQUIST u. HANNGREN 1966), wobei diese Fluoreszenz durch das Naphtacen-Gerüst der Tetracycline verursacht wird (DÄMM-RICH 1969). GEMMER et al. untersuchten 1973 mittels UV-Licht Knochen von geschlachte-ten Schweinen, Kälbern und Rindern auf Rückstände von Tetracyclinen und erhielgeschlachte-ten häufig positive Befunde. KÜHNE und EBRECHT kombinierten 1993 erstmals die rein qualitative Untersuchung mittels Fluoreszenz-Nachweis unter UV-Licht mit der sowohl qualitativ als auch quantitativ aussagekräftigen Untersuchungsmethode der HPLC (High Performance Li-quid Chromatography). Sie stellten bei ihren Untersuchungen an Knochen von Schlachttieren fest, dass in den meisten Fällen einer positiven Knochenfluoreszenz gleichzeitig Tetracyclin-rückstände in den dazugehörigen essbaren Geweben nachgewiesen werden konnten. Damit wurde gezeigt, dass die Untersuchung der Knochen von geschlachteten Tieren mittels UV-Licht als ein schnelles und problemloses Screeningverfahren im Rahmen der Rückstandskon-trolle angesehen werden kann (KÜHNE u. EBRECHT 1993).

Die hohe Prävalenz von Tetracyclin-Rückständen in den Knochen tauglich beurteilter, ge-schlachteter Schweine wurde durch die Untersuchungen von KÜHNE et al. (2000) belegt: In norddeutschen Schlachthöfen wurden insgesamt 17.150 tauglich beurteilte Schlachtkörper von Mastschweinen auf Fluoreszenz der Knochen untersucht. Nur 30 % der Mastschweine konnten als negativ beurteilt werden.

2.1.7.3 Risikoabschätzung gebundener Tetracyclin-Rückstände

Eine Möglichkeit des Eintrags von tetracyclinhaltigen Knochenpartikeln in die menschliche Nahrungskette ist z. B. der Verzehr von maschinell entbeintem Fleisch, in dem sich je nach

Herstellungsverfahren bis zu 5 % Knochenpartikel befinden können (VARNAM u. SUT-HERLAND 1995). Seit der ersten, im Jahr 1969 veröffentlichten Risikoabschätzung für Tetracyclin-Rückstände in Knochen geschlachteter Tiere wurde im wissenschaftlichen Schrifttum angenommen, dass gebundene Tetracycline antimikrobiell inaktiv sind und somit kein potentielles Risiko für den Verbraucher darstellen (WHO 1969; STAHLMANN u. LO-DE 2001). In einem in vitro-Verdauungsversuch untersuchten KÜHNE und KÖRNER (2001b) die Bioverfügbarkeit von gebundenen Chlortetracyclin-Rückständen in Knochensplit-tern, indem sie ein mit den Knochensplittern kontaminiertes Modellbrät mit 0,3 mol/l HCl und Pepsin bei 40 °C unter Rühren für 30 min inkubierten. Durch diese Simulation physiolo-gischer Verdauungsvorgänge ließen sich die gebundenen Rückstände von CTC im Mittel zu 35,3 % in die lösliche Form überführen; von dieser Konzentration waren 51,6 % antimikro-biell aktiv. Diese Ergebnisse sind ein Hinweis darauf, dass oral aufgenommene, gebundene Tetracyclin-Rückstände durch Verdauungsvorgänge zumindest teilweise ihre antimikrobielle Aktivität wiedererlangen könnten.

Im Rahmen einer experimentellen Gelatineherstellung aus tetracyclinhaltigen Schweinekno-chen konnte WEIDENBERG (2002) sowohl in Gelatine, die unter sauren Aufschlussbedin-gungen hergestellt worden war, als auch in handwerklich hergestellter Gelatine Rückstände von Tetracyclinen nachweisen.

2.1.7.4 Hitzestabilität gebundener Tetracyclin-Rückstände in Knochen

Die Auswirkungen von Hitze auf gebundene Tetracyclin-Rückstände wurden von KÖRNER (2000) anhand von Handelsproben CTC- und TC-haltiger Fleischknochenmehle, die auf 100

°C und 133 °C erhitzt wurden, untersucht. Die Hocherhitzung auf 133 °C über einen Zeitraum von 45 min führte im Mittel zu einer Reduktion der in den Fleischknochenmehlen nachgewie-senen CTC-Konzentration auf 11 % des Ursprungsgehaltes, während TC um ca. 50 % redu-ziert wurde. Im Vergleich dazu hatte die Hitzeeinwirkung von 100 °C keine Abnahme der nachweisbaren Konzentrationen von CTC und TC zur Folge.

In späteren Untersuchungen von KÜHNE et al. (2001a) an tetracyclinhaltigen Fleischkno-chenmehlen, die auf 133 °C hocherhitzt wurden, konnten ATC und sein Epimer als Dehydra-tationsprodukte von TC nachgewiesen werden. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass

eine Hocherhitzung auf 133 °C nicht allein zu einer Reduktion von TC führt, sondern viel-mehr zu einem quantitativen Umbau zu ATC.

Im Vergleich zu gebundenen Tetracyclin-Rückständen sind Rückstände von Tetracyclinen z.B. in Fleischerzeugnissen weitaus empfindlicher gegenüber Hitzebehandlungen: In HPLC-Studien an Brühwürsten aus mit OTC und CTC dotiertem Fleisch beobachtete KLEBINGER (1992) im Temperaturbereich von 68 °C - 72 °C einen OTC- und CTC-Abbau von 20 % in-nerhalb von 50 min. Eine stärkere Abnahme der Wirkstoffkonzentration durch den Brühpro-zess zeigte sich bei Temperaturen von über 75 °C nach 30 min; hier trat bei OTC ein Wirk-stoffverlust von 40 % ein, während die Konzentration von OTC um 60 % reduziert wurde.

ROSE et al. (1996) untersuchten mit der HPLC-Methode die Stabilität von OTC in Wasser und in Pflanzenöl und stellten in Wasser bei 100 °C, 80 °C und 62 °C Halbwertszeiten von 2, 15 und 120 min fest. In Öl wurde die OTC-Konzentration bei 110 °C nach 150 min um 25 % verringert; bei 180°C betrug die Halbwertszeit 8 min.

Unter Verwendung von mikrobiologischen Methoden untersuchten EGMOND et al. (2000) das Hitzeresistenzverhalten von OTC, indem sie ein Homogenisat aus Schweinefleisch, -niere und –leber mit OTC dotierten und verschiedenen Hitzebehandlungen unterzogen: Nach einer Erhitzung im Wasserbad bei 80 °C für 15 min wurde ein Aktivitätsverlust von 20 % festge-stellt, und die anschließende Hocherhitzung auf 134 °C bei 3 bar über den Zeitraum von 20 min führte zu dem vollständigen Aktivitätsverlust von OTC.