Le récepteur de membrane externe HasR

Le récepteur de membrane externe HasR est une protéine de 865 résidus appartenant à la famille des récepteurs TonB-dépendant dont l’homologie de structure est importante malgré une identité de séquence faible. HasR possède 21 % d’identité de séquence avec FecA d’E. coli, récepteur au citrate de fer, avec lequel HasR possède la plus forte identité de séquence parmi les récepteurs d’E.

coli. Le peptide signal, clivé lors de l’exportation, précède la séquence protéique en terminal. La structure primaire se partage en 3 régions : la région N-terminale (résidus 1-100), le bouchon (résidus 101-239) contenant la boîte TonB (résidus 101-109), et le tonneau transmembranaire (résidus 240-865) (Figure 16).

Le système has de Serratia marcescens

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In silico, le modèle structural prédit un tonneau formé de vingt-deux brins bêta, associés en feuillets antiparallèles, insérés dans la membrane externe. Les brins sont connectés par des boucles du côté extracellulaire, et des coudes du côté périplasmique. Le bouchon, obstruant le tonneau, contient 5 hélices alpha, et 7 brins bêta. Les deux histidines conservées dans les récepteurs à hème/hémoprotéines sont aussi présentes dans HasR. Elles sont localisées dans le bouchon pour l’histidine 189 et dans le tonneau pour l’histidine 603. In silico, la modélisation du récepteur par rapport aux récepteurs FhuA, FecA, FepA, et BtuB, localise ces deux histidines du côté extracellulaire (dans deux boucles du bouchon et du tonneau), accessibles au solvant, et proches l’une de l’autre dans l’espace.

Figure 16 : Représentation linéaire de HasR avec ses différents domaines.

La structure primaire du récepteur se partage en 3 régions : l’extension régulatrice N-terminale (jaune), le bouchon (rose), et le tonneau transmembranaire (bleu). La boîte TonB, localisée dans le bouchon, sépare celui-ci de l’extension régulatrice. Le peptide signal est clivé durant l’exportation. Les deux histidines conxervées du récepteur HasR sont représentées en rouge.

Abbildung 16 : Domänen von HasR.

HasR besteht aus drei Domänen: einer N-terminalen Signal-Domäne (gelb), der Plug-Domäne (pink) und dem transmembranen ß-Barrel (blau). Die TonB-Box befindet sich im Plug, nahe der periplasmatischen N-terminalen Signal-Domäne.

Les 100 premiers résidus constituent l’extension N-terminale. Comme dans le cas du récepteur FecA au citrate de fer, l’extension N-terminale est dédiée à la régulation de l’expression du récepteur et intervient dans la transduction du signal lors de la fixation de l’holohémophore sur le récepteur (Rossi et al., 2003) et ne joue pas de rôle dans le transport.

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3.2.2.2.2 Fonction reconstituée chez E. coli

Une souche hemA de S. marcescens est capable d’utiliser l’hème extracellulaire comme source d’hème jusqu’à de très faibles concentrations (10^-8 M) ; la délétion du gène hasR dans une telle souche ne permet plus l’utilisation de l’hème extracellulaire qu’à une concentration de 10^-6 M ; il est probable que l’existence d’autres récepteurs à hème (cf chapitre précédent) permette cette croissance. Pour s’affranchir de ces interférences le système a été reconstitué chez E. coli K12 qui n’exprime pas de récepteur à hème. Le transport de l’hème est reconstitué chez un mutant ΔhemA d’E.coli incapable de synthétiser l’hème b.

En absence de source fermentable de carbone, cette souche ne peut pas utiliser l’hème extracellulaire et a besoin d’acide delta-aminolévulinique (précurseur de la voie de biosynthèse de l’hème) pour pousser. L’expression du récepteur HasR, dans cette souche, lui permet d’internaliser l’hème à partir du milieu environnant et de l’utiliser comme source d’hème. Ce dernier peut être apporté libre à partir d’hémine, sous forme d’hémoglobine, ou bien lié à l’hémophore HasA (Ghigo et al., 1997).

Chez E. coli, le complexe TonB et la force proton-motrice sont requis pour le transport de l’hème par HasR. Cependant les caractéristiques varient selon la source d’hème, hémine ou hémoglobine d’un côté, HoloHasA de l’autre. Dans le cas où HoloHasA est utilisé, la croissance est possible jusqu’à 10^-8 M, tandis que l’hémine ou l’hémoglobine ne permet une croissance que jusque vers 10^-6 M.

Cependant l’utilisation de HoloHasA nécessite une plus grande force proton motrice et une plus grande quantité de complexe TonB. Dans le système reconstitué, l’augmentation de la concentration intracellulaire du complexe TonB peut être induite physiologiquement par la carence en fer (cf chapitre précédent) ou de manière artificielle grâce à un plasmide multicopie permettant l’expression des gènes du complexe. Dans un milieu non carencé en fer, la quantité de complexe TonB est trois fois inférieure par rapport à un milieu carencé (Higgs et al., 2002). La surexpression des protéines ExbB, ExbD, TonB restaure l’acquisition de l’hème via HasA jusqu’à la concentration de 10^-8 M dans un

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milieu non carencé en fer (Létoffé et al., 2004). Enfin, à basse concentration de complexe TonB, HasA inhibe l’acquisition de l’hème via HasR. Le complexe TonB remplit une double fonction dans le cas où HoloHasA est utilisé comme source d’hème. Il est nécessaire au transport de l’hème et à l’éjection de l’apohémophore du récepteur. Ceci a été étudié en mesurant le relargage d’hémophore marqué par un hémophore non marqué sur des cellules exprimant le récepteur. Cette éjection ne peut avoir lieu que si de l’hème est présent dans le système (Létoffé et al., 2004) et dans des cellules métaboliquement actives. (Figure 17).

Figure 17 : Quantité de complexe TonB/ExbB/ExbD requise en fonction du substrat source d’hème.

Le transport de l’hème libre requiert une faible quantité de complexe TonB/ExbB/ExbD et un faible niveau de PMF. Dans ces conditions, la présence de HoloHasA inhibe le transport de l’hème (I). Le transport de l’hème à partir de l’holohémophore requiert des quantités de complexe TonB/ExbB/ExbD plus importants et un niveau élevé de PMF, qui sont nécessaires pour le transport de l’hème à travers le récepteur et le recyclage de l’apohémophore (II).

Abbildung 17 : Menge an TonB/ExbB/ExbD, die für den Häm-Transport mit dem Substrat Hämquelle benötigt wird.

Transport von freiem Häm benötigt nur wenig TonB/ExbB/ExbD-Komplex und geringe PMF. Unter diesen Bedingungen inhibiere HoloHasA den Häm-Transport (I). Häm-Transport vom Hämophor aus benötigt ein höheres Expressionslevel an TonB/ExbB/ExbD und mehr PMF. Der erhöhte Energieverbrauch wird für die Dissoziation des Hämophors vom Rezeptor benötigt (II).

Chez E. coli, la protéine HasB ne complémente aucune des fonctions de TonB et n’est pas non plus active pour le transport de l’hème via HasR.

Cependant un mutant de hasB, hasB6, permet chez E. coli la synthèse d’une protéine HasB6 active en ce qui concerne le transport de l’hème via HasR, mais ne complémente pas les autres fonctions de TonB. La mutation hasB6, qui correspond à la duplication de deux codons conduit à la synthèse d’une protéine

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dont l’ancre transmembranaire comporte deux résidus supplémentaires, ce qui pourrait favoriser son interaction avec ExbB-ExbD (Paquelin et al., 2001).

3.2.2.2.3 Rôle des différents domaines du récepteur dans sa fonction

Le récepteur est composé de deux domaines importants dans le transport de l’hème. Dans son intégralité, le récepteur HasR permet l’entrée de l’hème libre, ou via l’hémophore, par un mécanisme TonB-dépendant. In vivo, Le tonneau bêta (HasRΔ11-192) exprimé seul, est inséré dans la membrane externe et permet d’acquérir spécifiquement l’hème par diffusion facilitée. L’histidine conservée du tonneau est requise pour sa diffusion. La mutation de celle-ci abolit l’internalisation de l’hème. Le bouchon (HasR1-242), exprimé seul, est localisé dans le périplasme ; en présence du tonneau, il est colocalisé avec le tonneau dans la membrane externe. Cependant, l’expression séparée du bouchon (HasR1-242) et du tonneau dans la même bactérie ne permet ni d’augmenter la diffusion facilitée de l’hème, ni de reconstituer un récepteur fonctionnel pour le transport actif de l’hème (Létoffé et al., 2005). Les sites de fixation de HasA ne sont pas encore identifiés sur HasR. Cependant l’affinité de HasA pour les différents domaines de HasR, a été testée in vitro et in vivo. In vitro le bouchon HasR1-242 ne fixe pas l’hémophore. L’étude réalisée in vivo sur le tonneau bêta montre une affinité réduite de HasA avec HasRΔ11-192. De plus, la coexpression séparée des deux parties n’augmente pas le taux de fixation de l’hémophore. La fixation de HasA sur HasR pourrait faire intervenir essentiellement des résidus du tonneau (Létoffé et al., 2005).