Quantitative Genexpression

Startmaterial und Enzymatik

Entscheidend für den Erfolg einer Expressionsanalyse ist auch die Qualität des Startmaterials (Oeth et al., 2005). Nur gut erhaltene mRNA liefert eine vollständige cDNA, die zu zufriedenstellenden Resultaten führt, wohingegen degradierte mRNA, die zum Beispiel mehrfach aufgetaut wurde, keine validen Resultate mehr liefern kann.

Für den humanen Testplex wurde die RNA aus frischen, lebenden Lymphozyten extrahiert und unmittelbar nach der Quantifizierung und qualitativer Beurteilung der reversen Transkription zugeführt, so dass hier eine Degradierung ausgeschlossen werden kann.

Expressionslevel

Für eine gelungene Quantifizierung im Multiplex ist von Bedeutung, dass besonders bei gering exprimierten Genen die Gene eines Multiplexes etwa das gleiche Expressionsniveau haben (Sequenom, mündliche Mitteilung, 2007). Bei zu großen Konzentrationsunterschieden der templates eines Multiplexes besteht sonst die Gefahr, dass gering exprimierte Gene gegenüber stärker exprimierten Genen bei der exponentiellen Amplifikation in der PCR vernachlässigt werden und so nicht mehr detektierbar sind bzw. zu geringe und nicht reproduzierbare Ergebnisse produzieren.

Die Arbeitsgruppe um Turakulov untersuchte hierzu das Expressionsniveau von sechs Genen in der Sojabohne und konnte die besten Multiplex- Ergebnisse gewinnen, wenn die mRNA- Konzentrationen im Ursprungsgewebe nicht mehr als um den Faktor zehn variierten (Turakulov et al., 2007).

Bei einer Untersuchung von 12 humanen Genen in Zelllinien, die unter unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen gezüchtet wurden, konnte die Expression dieser Gene erfolgreich im Bereich von 100fM bis 1fM bestimmt werden. Dabei wurden die Plexe so ausgewählt, dass die zusammen prozessierten Gene in etwa im gleichen cDNA- Konzentrationsniveau lagen (Elvidge et al, 2004).

Die humanen Housekeeping Gene waren erwartungsgemäß stark exprimiert und umfassten Konzentrationsbereiche von 10fM bis 1pM. Damit ist die Streuung relativ groß, jedoch scheint hier höchstens eine geringe Auswirkung auf die Ergebnisse erfolgt zu sein.

Ob die Differenzen in der Konzentration und damit in der Expression sich tatsächlich in größerem Umfang auf die Qualität der Resultate auswirken, kann mit den vorliegenden Daten nicht abschließend beurteilt werden.

Standardabweichung der Replikate und Wiederholungen

Um die Messgenauigkeit zu erhöhen wurde in dieser Arbeit jeder Messpunkt in vier Replikaten prozessiert. Damit sollte kontrolliert werden, ob zum Beispiel Pipettierfehler vorlagen oder eventuelle Schwankungen in der Laserintensität die Ergebnisse beeinflussen. Dabei sollte die Standardabweichung der Replikate nicht höher als 10% sein. Bei höherer Standardabweichung können die erzielten Mittelwerte nicht mehr als valide angesehen werden. In die Auswertung wurden immer mindestens zwei Replikate mit einbezogen, Ergebnisse mit R²- Werten kleiner als 0,90 oder offensichtliche Ausreißer aus der sigmoidalen Kurve wurden verworfen.

Der Kurvenverlauf der einzelnen Gene des verwendeten 10- Plexes war bei der logarithmischen Kompetitorverdünnungsreihe in fast allen Fällen annähernd sigmoidal und es konnten sehr gute R²- Werte erzielt werden. Es zeigte sich aber, dass die Kurven mit kleineren Kompetitorverdünnungsschritten unruhiger wurden und die R²- Werte geringer waren als bei der logarithmischen Verdünnungsreihe. Im Gegensatz dazu waren die Standardabweichungen zwischen den einzelnen Replikaten geringer.

Ding und Mitarbeiter konnten in drei Uniplexen eine Standardabweichung zwischen einer unbekannten Anzahl an Replikaten von weniger als 3% erreichen (Ding and Cantor, 2003). Zu beachten ist hierbei, dass die Expression der von dieser Arbeitsgruppe verwendeten Gene mit 10^-6 – 10^-7 im Vergleich zu den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Genen um ein Vielfaches höher lagen. Bei allen anderen publizierten QGE- Studien liegt die Standardabweichung mit unter 10% im gleichen Größenbereich wie in der vorliegenden Arbeit (McCullough et al, 2005)

PCR- und Primeroptimierung

Schwankungen in der Extensionsprimerumsetzung innerhalb der einzelnen Replikate weisen auf eine instabile PCR- Reaktion hin. Während die Extensionsprimerreaktion sehr robust funktioniert, sind Multiplex PCR- Reaktionen sehr anfällig für Störfaktoren. Deshalb scheint es nötig, sowohl die einzelnen PCR-Reaktionen als

auch den ganzen QGE-Multiplex dahingehend zu optimieren, dass für jedes Gen multiple Primerkombinationen getestet werden, und nur sehr stabile PCR-Reaktionen zu einem Multiplex zusammengesetzt werden können. Nur dann kann eine kompetitive PCR im Multiplex quantitativ ablaufen (Sequenom 2008, mündliche Mitteilung).

6.2.1 Abschließende Beurteilung

Die quantitative Genepressionsanalyse mittels kompetitiver PCR (rcPCR) und anschließender massenspektrometrischer Bestimmung bietet den großen Vorteil, dass das gene of interest zusammen mit dem internen Standard, in der Regel einem housekeeping Gen, auf das später normalisiert werden soll, zusammen in einer Reaktion prozessiert werden können. Somit werden Schwankungen zwischen einzelnen Versuchen vermieden, die eine Normalisierung erschweren könnten.

Quantitative Untersuchungen mit real time PCR ermöglichen moderaten Durchsatz, und Multiplexen ist nur bedingt möglich, da nur eine begrenzte Anzahl an Fluoreszenzfarbstoffen zur Verfügung steht. Die in der vorliegenden Arbeit validierte rcPCR verzichtet auf die Verwendung von Farbstoffen oder Sonden, die Bestimmung erfolgt direkt anhand der Intensitäten im MALDI- TOF, was die Flexibilität der Methode steigert und Multiplexen möglich macht.

Bei der Planung eines QGE- Experiments sind einige Besonderheiten zu beachten, um reliable Ergebnisse zu erzielen. Von besonderer Bedeutung ist die Qualität des Startmaterials. Es empfiehlt sich, nur frische mRNA zu verwenden, da jegliche Degradierung zu schlechteren Ergebnissen und verringerter Reduzierbarkeit führt.

Im Vorfeld muss abgeklärt werden, auf welchem Expressionslevel sich die zu untersuchenden Gene bewegen. Dies kann entweder durch Datenbankrecherche basierend auf bereits bekannten Expressionsdaten geschehen, oder aber experimentell, indem die einzelnen Gene mit der QGE- Methode in einem initialen Experiment untersucht werden, und dann die einzelnen assays, abhängig von ihren mRNA- Konzentrationen, miteinander kombiniert werden.

Die mRNA- Konzentrationen sollten hierbei den Bereich von 10fM bis 10pM einhalten, geringere Konzentrationen könnten dazu führen, dass sich eventuelle Pipettierungenauigkeiten zu stark auf die Ergebnisse auswirken.

Für alle durchzuführenden PCR- Reaktionen empfiehlt es sich, mehr als eine Primerkombination zu testen, und nur stabile PCR- Reaktionen in einen Multiplex

aufzunehmen. Gegebenfalls kann eine PCR- Optimierung mit variabler Primermenge hilfreich sein, ebenso wie ein vergrößertes PCR- Volumen, um Pipettierfehler abzuschwächen (Elvidge et al, 2004).

Bei der Zusammenstellung der Plexe bietet sich zu Beginn ein geringes Plexlevel an, um Interferenzen zwischen den einzelnen PCR- Reaktionen zu vermeiden. Eventuell ist dann eine sukzessive Erhöhung der Plexrate möglich. Dabei sind die zu untersuchenden Genen so zusammenzustellen, dass ihre mRNA- Konzentrationen im verwendeten Gewebe nicht um mehr als den Faktor zehn schwanken. So kann vermieden werden, dass stark exprimierte Gene schwächere während der PCR unterdrücken.

Unter Beachtung dieser Besonderheiten bietet die QGE- Methode eine vielversprechende Alternative zur herkömmlichen real time PCR (rtPCR), um Kandidatengene wie HTR2A auf ihre funktionelle Relevanz zu untersuchen. Um die Reproduzierbarkeit und Funktionalität über verschiedene Gewebe oder auch Spezies hinweg zu gewährleisten, werden allerdings noch weitergehende Untersuchungen von Nöten sein. Das Serotonin- 2A- Rezeptorgen könnte sich hier als geeignet erweisen, da zum einen bereits Expressionsdaten aus verschiedenen Gehirnregionen bekannt sind (Genecards, 2009) und zum anderen differentielle Genexpression bei schizophrenen Patienten berichtet wurde (z.B.: (Burnet et al., 1996b; Hernandez und Sokolov, 2000; Lopez-Figueroa et al., 2004; Polesskaya und Sokolov, 2002).