Purification and characterization of synaptosomes

Figure 3‐1: Experimental outline of the project. 

The schematic illustrates the experimental flow performed to determine the pre‐synaptic  architecture:  synaptosomes  were  purified  and  characterized  (3.1).  Next,  their  physical  characteristics were determined using 3D reconstruction EM (3.2) followed by absolute protein  quantification per synapse (3.3) and determining the organization of the proteins within the  synapse (3.4). The information obtained from these sets of experiments was then used to  generate a graphical model of the average pre‐synaptic terminal (3.4). 

3.1 Purification and characterization of synaptosomes 

As outlined in the previous section, the main goal of this study was to investigate the  molecular architecture of a pre‐synaptic terminal. The model system I used to address this  question was isolated nerve terminals – so called synaptosomes  ‐ from rat brains. During  homogenization of the brain material, the pre‐synaptic terminals get ripped off of the neuronal  processes. These are then isolated via consecutive differential and gradient centrifugation steps  (see detailed protocol in 2.5). In principle, the synaptosomes are intact and maintain their  neurophysiological properties (Fischer von Mollard et al., 1991). For this study I used only cortex  and cerebellum as starting brain material. By using only these two areas of the brain I was able  to limit the variability of synapse populations to a certain extend and ensured that I still had  enough brain material per animal to perform multiple quantification experiments. 

For the purpose of investigating the molecular architecture of the terminal, it was not  crucial to work with ultra‐pure synaptosome preparation (Dunkley et al., 2008). As outlined in  the next sections, the contaminations I found in the synaptosome preparations were mainly of  mitochondrial and myelin origin. These types of contamination neither biased the determination  of  the  physical  characteristics  (3.2)  nor  the  protein  quantification  (3.3,  as  all  proteins  investigated are majorly pre‐synaptic). However, especially the latter depended entirely on  actually knowing how pure the fractions were – i.e. how many synaptosomes are present per µg  of total protein. To address this question I developed two different assays. The first relied on  determining the amount of synaptosome particles in a fluorescence‐based assay and the second  on identifying the different components per fraction in an ultrastructural assay. The results of  these two approaches are outlined in the next paragraphs (for detailed protocols refer to  section 2.7) while a comparison of the two assays as well as an evaluation of the results is  provided in 3.1.3. 

3.1.1 Determining the fraction of synaptosome particles using a fluorescence assay 

The first assay relied on determining the amount of synaptosomes from all particles in a  synaptosome fraction using fluorescence microscopy. For this purpose, defined amounts of the  synaptosome fractions were immobilized on glass cover‐slips via centrifugation (spin down) and  immunolabeled for different marker proteins: (i) Synaptotagmin 1 as a marker for SVs and  ultimately synaptosomes, (ii) Bassoon or PSD‐95 as markers for the pre‐ or the post‐synaptic  compartment respectively. As a positive control – i.e. a marker which labels all particles – I used  TMA‐DPH which is a hydrophobic fluorescent probe used to label membranes (Illinger et al.,  1989). This allowed me to determine the total number of particles (TMA‐DPH labeling) and the  fraction of synaptosome particles (defined as Synaptotagmin 1 positive particles). Knowing the  amount of starting material which was spun onto the cover‐slips as well as the imaging area, it is  possible to calculate the absolute amount of synaptosomes in each preparation. Representative  images from this assay can be found in Figure 3‐2 A. Analyzing the images from seven to eight  independent experiments per condition showed that all synaptosome preparations (S1‐4)  contained between 51 and 54 % of synaptosome particles.   

Figure 3‐2: Fluorescence spin down assay to determine purity of synaptosome preparations. 

(A) Representative images from the fluorescence spin down assay. The immobilized particles are  immunolabeled for Bassoon (red) and Synaptotagmin (green). The total pool of particles is  labeled with TMA‐DPH (blue). Size bar is 2.5 µm. 

(B) Quantification of the data obtained in the fluorescence spin down assay. Bars represent the  fraction of synaptosome particles in the four different preparations (S1‐4). Graph show mean ±  SEM from at least 7 independent experiments. 

However, as this  assay is critically dependent  on how efficient the particles are  immobilized (spun down) on the cover‐slips it is necessary to determine the efficiency of the  spin down. This was done comparing the amount of two prominent pre‐synaptic marker  proteins – Syntaxin 1 and Synaptobrevin 2 – in the supernatant after spin down (sample) with  the input material prior to spin down (control).   The results of this control experiment are  displayed in Figure 3‐3: the average efficiency of the spin down was 98.68 % (mean of 99.63 %  for  Syntaxin  1  and  97.74%  for  Synaptobrevin  2)  indicating  that  there  was  hardly  any  synaptosomes which did not get immobilized on the cover‐slips. Nevertheless, this value was  used as a correction factor for determining the amount of synaptosomes per fraction (i.e. values  in Table 3‐1 are corrected for the loss during centrifugation).  

Although the synaptosomes are substantially diluted – and therefore well separated –  before being immobilized it is still possible that some particles might have been aggregated into  clumps. In this case it would have been difficult to discern them using diffraction limited  microscopy, hence aggregation of synaptosomes pose a substantial bias to the quantification of  the number of synaptosomes per preparation. To test if this is the case I designed a second  assay, which relies on EM to determine the absolute amount of synaptosomes. The results of  this assay are outlined in the following section. 

  Figure 3‐3: Spin down efficiency assay. 

(A) Example blot showing the abundance of two pre‐synaptic marker proteins – Syntaxin 1 (Syx  1) and Synaptobrevin 2 (Syb 2) – in the supernatant prior to (Control) and after (Sample)  centrifugation. As indicated by the blots, there is hardly any protein detected in the supernatant  after spin down indicating that most of the synaptosomes are immobilized on the cover‐slip. 

(B) Graph shows the spin down efficiency  for the two marker proteins Syntaxin 1 and  Synaptobrevin 2. The dotted red line marks 100% spin down efficiency i.e. that all synaptosomes  are immobilized on the cover‐slip. Graph shows mean ± SEM from 8 independent experiments. 

3.1.2 Determining amount of synaptosomes using electron micrographs 

In order to test the results obtained by the fluorescence spin down assay I investigated  electron micrographs of the synaptosome preparations. As described in 2.7.2, all visible particles  in the EM images were first manually outlined/ selected and identified. This showed that  besides the synaptosomes the majority of the sample was composed of mitochondria, myelin  and post‐synapses. However, a small amount of objects (~14%) could not be identified as they  were either too small or unspecific in appearance.  

This data could further be used to control the quantification results obtained previously  from the fluorescence spin down assay. Unlike the spin down assay, this assay was not biased by  an accumulation of particles into clumps as all objects could be discerned individually in EM. In  order to determine the amount of synaptosomes per fraction, the relative volume of each  particle  group  (synaptosome,  post‐synapses,  mitochondria,  myelin  and  unknown)  was  determined (see Figure 3‐4). The fraction obtained for synaptosomes (i.e. the relative volume  occupied by synaptosomes in the fraction) could then be used as a control for the results of the  spin down assay.  

  Figure 3‐4: EM‐based assay to determine composition of synaptosome preparations. 

Graph shows the relative composition of the synaptosome preparations. Results are derived by  analyzing thin sectioned electron micrographs. Graph shows mean ± SEM of the four different  synaptosome preparations. 

3.1.3 The purity of the synaptosome preparations – comparing the two assays 

As outlined in the previous two sections, two different assays were employed to  determine  the  amount  of  synaptosomes  per  preparation.  The first  assay  depended  on  fluorescence microscopy to identify the amount of synaptosome particles from all particles. 

Results obtained with this assay where then validated using an EM‐based assay in which the  relative volume occupied by the synaptosomes in the preparation was analyzed. In Figure 3‐5,  the results of these two assays are compared with each other: the bars represent the relative  amount of synaptosomes determined with the fluorescence (black) and the EM‐based (grey)  assay.  

In summary, both assays delivered strikingly similar results concerning the amount of  synaptosomes per preparation. In addition, the EM‐based assay allowed characterization of  other  components of  the synaptosome  fractions.  The  results  (i.e.  absolute  numbers  of 

synaptosomes) of the assays are summarized in Table 3‐2. These values are crucial for further  quantitative experiments using the synaptosomes and will be used later to determine absolute  protein numbers per pre‐synaptic terminal (see 3.3). 

  Figure 3‐5: EM‐based assay confirms findings of the fluorescence spin down assay. 

Graph shows the fraction of synaptosomes per preparation (S1‐4) as determined with the  fluorescence spin down assay (black bars) compared to the EM‐based assay (grey bars). For the  fluorescence assay, bars represent mean ± SEM of at least 7 independent experiments. The bars  of the EM assay (grey) do not have error bars as they are derived from several images of only a  single experiment each (i.e. the respective preparation). 

Table 3‐1: Absolute numbers of synaptosomes per nanogram of preparation. 

Preparation  Synaptosomes per ng 

S 1  8532

S 2  10602

S 3  10518

S 4  10096