Proteinbiologische Methoden

31

32 Milch/TBST. Für die Markierung der Proteine mit primären Antikörpern wurden diese entsprechend in 5 % Milch/TBST verdünnt und für mind. 1 h jedoch meist über Nacht bei 4 °C geschwenkt.

Anschließend wurden ungebundene Immunglobuline in mindestens drei Waschschritten mit TBST entfernt. Der sekundäre Antikörper wurde ebenfalls in 5 % Milch/TBST verdünnt zu der Membran gegeben und für ca. 1 h schwenkend inkubiert. Danach wurde die Membran mindestens dreimal mit TBST gewaschen. Da die sekundären Antikörper HRP-konjugiert waren, erfolgte der Nachweis mittels ECL Plus Western Detection System (GE Healthcare) und X-ray Filmen (CIA) im Dunkeln oder aber mit einer Diaminobenzidin/Nickelchlorid-Färbelösung (100 mM Tris/HCl pH 7,5; 4 mg/ml Diaminobenzidin; 2 mg/ml Nickelchlorid) bis Signale zu erkennen waren.

2.3.4. Nachweis von HA über Blue Native-Gelelektrophorese (BN)

Mit Hilfe der Blue Native-Gelelektrophorese können gefaltete Proteine in einem elektrischen Feld anhand ihrer Molekülgröße aufgetrennt werden, wodurch ein Nachweis von Oligomeren ermöglicht wird. In dieser Arbeit wurde sich an dem Protokoll von Wittig et al. orientiert [128].

Zellaufschluss und Solubilisierung von Hämagglutinin: Ca. 200 ODE einer Hefekultur wurden bei 4.000 rpm für 5 min pelletiert und einmal mit Wasser gewaschen. Das Zellpellet wurde in 3 ml Lysispuffer resuspendiert und je 600 µl wurden zusammen mit Glasperlen aliquotiert. Der Aufschluss erfolgte mittels Vibrax-Schüttler für viermal 3 min, wobei die Proben zwischendurch für 5 min auf Eis gekühlt wurden. Zur Abtrennung von großen Zellbestandteilen und nicht aufgebrochenen Zellen wurde der Extrakt 5 min bei 150 x g zentrifugiert und anschließend die Überstände vereinigt. Um Membranen zu pelletieren wurde der Extrakt anschließend für 40 min bei 21.000 x g zentrifugiert. Da Hämagglutinin ein Membranprotein ist, musste es vor der Elektrophorese aus diesen gelöst werden.

Dazu wurde das Pellet in 220 µl Solubilisierungspuffer resuspendiert und 44 µl 1 %iges Lauryldimethylaminoxid (LDAO) dazu gegeben. Die Proben wurden 1 h bei RT inkubiert und anschließend für eine weitere Stunde bei 21.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 5 µl 50

%igem Glycerin und 1 µl 5 %igem Coomassie Brilliantblau G250 versetzt.

BN-Gelelektrophorese und Western Blot: Die nativen Gele für die Elektrophorese wurden in den Mini-PROTEAN-Apparaturen gegossen, aufgetrennt und transferiert. In Abweichung vom Protokoll wurde ein kontinuierliches Trenngel verwendet, bei dem die Acrylamid-Konzentration bei 7 % lag(25 mM Imidazol/HCl pH 7,0; 167 mM 6-Aminohexansäure; 7 % PAA; 0,067 % APS; 0,067 % TEMED).

Darauf wurde ein Sammelgel geschichtet (25 mM Imidazol/HCl pH 7,0; 167 mM 6-Aminohexansäure;

3,5 % PAA; 0,084 % APS; 0,084 % TEMED). Die polymerisierten Gele wurden zusammen mit Anoden-Puffer und Kathoden-Anoden-Puffer B in die Apparaturen eingespannt. Es wurden 4 µl Probe aufgetragen und die Elektrophorese erfolgte zunächst bei bei 100 V und 4 °C. Als die Lauffront 1/3 des Gels

33 durchlaufen hatte, wurde der Kathoden-Puffer B gegen Kathoden-Puffer B/10 ausgetauscht und die Elektrophorese fortgesetzt. Nachdem die Lauffront das Ende des Gels erreicht hatte, wurden die aufgetrennten Proteine mittels Western Blot analysiert. Dies erfolgte wie unter 2.3.3 beschrieben, außer das nach dem Proteintransfer die Membran zum Entfärben des Coomassie-Farbstoffes die Membran kurz in Methanol geschwenkt wurde, bevor sie mit 5 % Milch/TBST blockiert wurde.

2.3.5. Immunfluoreszenz

Die Immunfluoreszenz diente der Lokalisierung von Fremdprotein in der Hefezelle. Zur Fixierung der Proteine und Aufrechterhaltung der Zellstruktur wurden die zu untersuchenden Hefen mit 5 % Formaldehyd versetzt und für 3 h bei 30 °C inkubiert. Danach wurden die Zellen bei 4.000 rpm für 1 min zentrifugiert, einmal in Sorbitol-Puffer gewaschen und schließlich über Nacht in Sorbitol-Puffer bei 4 °C gelagert. Am Folgetag wurden die Glukane der Zellwände mittels Zymolyase-Puffer für 45 min bei 37 °C hydrolysiert. Um unspezifische Bindungen der Antikörper zu verhindern, wurde nach einem Waschschritt (Sorbitol-Puffer) mit 3 % BSA/PBS für 30 min bei RT blockiert. Anschließend wurden die Zellen mit den primären Antikörpern (1:50 Verdünnung für anti-HA-Tag AK bzw. 1:25 für CM1-1 in 3 % BSA/PBS) für 90 min bei RT inkubiert. Nach viermaligen Waschen mit PBS erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper (1:500 anti-mouse-Alexa555 AK in 3 % BSA/PBS) für eine Stunde bei RT im Dunkeln. Schließlich wurden die Hefen erneut viermal mit PBS gewaschen. Die Markierung der DNA zur Lokalisierung der Zellkerne erfolgte mit DAPI (1 µg/ml) für weitere 10 min bei RT im Dunkeln. Nach einem letzten Waschschritt mit PBS wurde die Suspension auf einen Objektträger gebracht und zusammen mit einem Deckgläschen mit Nagellack versiegelt. Die mikroskopischen Aufnahmen erfolgten an einem Axioskop mit CCD-Kamera (Photometrix).

2.3.6. Aufreinigung von IBDV-VP2 aus Hefezellen

Für die Aufreinigung von subviralen Partikeln aus Hefezellen wurde sich an den Arbeiten von Caston et al., Garriga et al. sowie Pous et al. orientiert [129];[130];[131].

Zunächst wurden 400 ml 2 % Laktose-Vollmedium mit einer Vorkultur angeimpft und über Nacht bei 30 °C angezogen. Die Zellen wurden bei 2.000 x g für 5 min zentrifugiert und das Pellet einmal mit Wasser und ein weiteres Mal mit 1 M Sorbitol-Puffer gewaschen. Anschließend wurde das Zellpellet in 5 ml Lysispuffer resuspendiert und je 700 µl wurden zusammen mit Glasperlen (ca. 300 µl) aliquotiert. Der Zellaufschluss erfolgte mittels Vibrax-Schüttler für viermal 3 min, wobei die Proben zwischendurch für 5 min auf Eis gekühlt wurden. Zum Abtrennen der Zelltrümmer wurde anschließend zentrifugiert (16.000 x g, 5 min und 4 °C) und die Überstände aus den einzelnen Aliquot vereinigt. Das Lysat wurde nochmals zentrifugiert (10.000 x g, 1 h, 4 °C) und mit gleichem Volumen des organischen Lösungsmittels Vertrel® XF (Dupont de Nemours) versetzt. Danach wurde der Ansatz 2 min homogenisiert und für 2 min bei 2.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand (ca. 7,5 ml)

34 wurde nochmals mit Vertrel® XF extrahiert und anschließend auf 4,5 ml Saccharose/PES-Puffer geschichtet. Die Auftrennung der Proteine durch das Saccharose-Kissen erfolgte bei 170.000 x g für 3 h bei 4 °C. Vom Saccharose-Kissen wurden 1 ml-Fraktionen mit einer Pipette von oben abgenommen, wobei das Pellet in der letzten Fraktion resuspendiert wurde. Für die Ausbildung des Saccharose-Gradienten wurden je 4 ml 18 %, 36 % und 54 % Saccharose/PES-Lösungen in einem Röhrchen untereinander geschichtet und dieses waagerecht für 3 h bei 4 °C gelagert. Anschließend wurde der Gradient vorsichtig aufgerichtet und mit der Pellet-Fraktion des Saccharose-Kissens überschichtet. Der darauf folgende Zentrifugationsschritt erfolgte bei 4 °C für 18 h und 115.000 x g.

Geerntet wurde der Gradient in 700 µl-Fraktionen. Die Dichte der einzelnen Fraktionen wurde mit einem Refraktometer bestimmt und weitere Untersuchungen erfolgten mittels Western Blot Analyse und Elektronenmikroskopie.

2.3.7. Elektronenmikroskopie

Um das gereinigte VP2-Protein hinsichtlich möglicher Kapsidstrukturen untersuchen zu können, wurden die Fraktionen des Saccharose-Gradienten (vgl. 2.3.6) elektronenmikroskopisch untersucht.

Dafür wurden die Proben an Dr. Dr. Gerd Hause (MLU Halle-Wittenberg) übergeben, der diese teilweise immunogold-markiert im Negativkontrast analysierte. Dafür wurden 3 µl Probe auf Kupfer- oder Nickel-Grids mit einer Kohlenstoff/Fromvarbeschichtung getropft, 1 min inkubiert und dreimal mit bidest. Wasser gewaschen. Für die Immunogold-Markierung wurde der Grid mit anti-IBDV Antiserum (1:7.500) in PBS (versetzt mit 1 % acetyliertem BSA und 0,1 % Tween) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend erfolgten vier 15-minütige Waschschritte mit PBS-Puffer und eine Inkubation mit anti-rabbit-10 nm Gold AK (1:100 in PBS-Puffer) für 90 min bei RT. Danach wurden vier 5-minütige Waschschritte mit bidest. Wasser durchgeführt. Anschließend wurden die Grids auf einer 1 %igen Uranylacetat-Lösung platziert, für 25 s inkubiert und schließlich bei 37 °C getrocknet. Die Aufnahmen erfolgten mit einem EM 900 Elektronenmikroskop (Zeiss).

2.3.8. Expression von PR8-HA in E. coli

Für die Gewinnung von rekombinantem HA-Protein aus E. coli-Zellen wurden kompetente Rosetta (DE3) pLysS mit den Plasmiden pET21_PR8-HA bzw. pET21_PR8-HA‘(330) transformiert. Die Anzucht erfolgte in 25 ml LB-Medium (mit Ampicillin), das mit einer Vorkultur auf eine OD600 von 0,2 angeimpft und anschließend bei 37 °C auf einem Schüttler kultiviert wurde. Nachdem die Kultur eine OD600 von 0,5 erreicht hatte, wurde mit 1 mM IPTG die Expression des HA-Gens induziert. Nach drei Stunden wurden die Kolben zunächst für 5 min auf Eis abgekühlt und anschließend die Zellen bei 5.000 x g und 4 °C für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit 20 mM Tris/HCl pH 8,0-Lösung gewaschen und bis zum Zellaufschluss bei -70 °C gelagert.

35 Für den Zellaufschluss wurde das Pellet in 10 ml PBS resuspendiert und die Zellen mittels Ultraschall lysiert. Dafür wurden die Proben auf Eis zweimal für 45 s bei einer Amplitude von 40 % beschallt, wobei dazwischen 2 min pausiert wurde. Von dem Lysat wurde 1 ml abgenommen und für 10 min bei 14.000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde zur weiteren Analyse zusammen mit 5fach Ladepuffer für 10 min bei 95 °C denaturiert. Das Pellet wurde mit PBS gewaschen und in 200 µl 1x Ladepuffer/PBS resuspendiert und ebenfalls für 10 min bei 95 °C denaturiert. Die Analyse der Proben erfolgte mittels Coomassie-gefärbten SDS-Gelen und Western Analysen.

2.3.9. Isolierung von ER-Membranen

Zur genaueren Lokalisierung von HA in der Hefezelle wurden die endoplasmatischen Membranen von K. lactis-Zellen mittels differentieller Zentrifugation isoliert. Dafür wurde ein Protokoll verwendet, das auf der Arbeit von Wuestehube und Schekman basiert [132]. Ca. 800 ODE einer unter induzierten Bedingungen gewachsenen Hefekultur wurden für 5 min bei 4.000 rpm zentrifugiert, in 10 ml ER-Puffer I resuspendiert und für 10 min bei 25 °C inkubiert. Danach wurden die Zellen erneut für 5 min bei 4.000 rpm sedimentiert und in 10 ml ER-Puffer II aufgenommen. Um Spheroblasten zu erhalten wurden 65 µl Zymolyase (10 mg/ml) und 50 µl β-Mercaptoethanol hinzugegeben und der Ansatz für 1,5 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Spheroblasten bei 3.500 rpm für 10 min sedimentiert und zweimal mit Puffer III gewaschen. Das Hefepellet wurde dann in 0,5 ml ER-Puffer III resuspendiert und 10 ml eiskalter ER-ER-Puffer IV hinzugefügt. Durch sorgfältiges Homogenisieren und einer Inkubation von 10 min bei -20 °C wurden die Zellen lysiert. Für die Abtrennung größerer Zellbestandteile wurde anschließend bei 2.000 rpm für 5 min und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann 10 min bei 27.000 x g und 4 °C nochmals zentrifugiert und das Pellet in 0,3 ml ER-Puffer IV resuspendiert. Die Suspension wurde schließlich auf ein Saccharose-Kissen (0,4 ml 1,5 M Saccharose/ER-Puffer IV und 0,4 ml 1,2 M Saccharose/ER-Puffer IV) geschichtet und für 1 h bei 105.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Danach wurden vier in etwa gleich große Fraktionen mit einer Pipette von oben abgenommen.

Zur Solubilisierung der Membranproteine wurden jeweils 50 µl der Saccharose-Fraktionen mit 0,4 % Decyl-β-D-Maltopyranosid (DDM) und 0,16 % Cholesterylhemisuccinat (CHS) versetzt und 1 h bei 4 °C auf einem Rotator inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit 5fach Ladepuffer versetzt und die Proteine für 10 min bei 95 °C denaturiert. Die Analyse erfolgte im Western Blot.

2.3.10. Deglykosylierung von Hämagglutinin

Die Deglykosylierung von HA erfolgte mit dem Enzym PNGase F (NEB). Hierfür wurden 0,5 ODE einer Hefe-Kultur bei 8.000 rpm für 2 min zentrifugiert und das Pellet nach einem Waschschritt mit Wasser in 9 µl dest. Wasser aufgenommen. Zu der Suspension wurde 1 µl Denaturierungspuffer (NEB)

36 gegeben und für 10 min bei 94 °C denaturiert. Anschließend wurden folgende Reagenzien zum Ansatz dazu gegeben:

Tabelle 13: Übersicht der Reaktionsansätze bei der Deglykosylierung von HA mit PNGase F.

Reagenz PNGase F-Versuch Kontrollansatz

10x NP40-Puffer (NEB) 2,5 µl 2,5 µl

10x G7 Reaktionspuffer (NEB) 2,5 µl 2,5 µl

25x BSA (NEB) 1 µl 1 µl

PNGase F (NEB) 1,5 µl ---

Dest. Wasser 9,5 µl 11 µl

Die Ansätze wurden über Nacht bei 37 °C deglykosyliert und schließlich mit 5fach Ladepuffer versetzt nochmals für 10 min bei 95 °C denaturiert. Die Analyse erfolgte im Western Blot, wobei 8 µl des Reaktionsansatzes aufgetragen wurden.

2.3.11. Trypsinspaltung von Hämagglutinin

Trypsinspaltung mit Spheroblasten: Es wurden 45 ODE einer Hefekultur pelletiert (4.000 rpm, 5 min) und mit Sorbitol-Puffer gewaschen. Das Zellpellet wurde in Zymolyase-Puffer resuspendiert und die Hydrolyse der Zellwand-Glukane erfolgte für 1 h bei 37 °C. Die Proben wurden erneut in Sorbitol-Puffer gewaschen und auf drei Aliquot verteilt. Zu den Aliquot wurden 10 µg/ml oder 1 µg/ml TPCK-Trypsin gegeben bzw. die Kontrolle blieb unbehandelt. Alle Proben wurden für 1 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze mit 5fach Ladepuffer versetzt und für 10 min bei 95 °C denaturiert.

Trypsinspaltung von Proteinextrakten: 40 ODE einer Hefekultur wurden bei 4.000 rpm für 5 min pelletiert und einmal mit Wasser gewaschen. Das Pellet wurde in 600 µl Lysispuffer resuspendiert und mit Glasperlen (ca. 300 µl) versetzt. Für den Zellaufschluss wurden die Proben in einem Vibrax-Schüttler viermal für 3 min geschüttelt und zwischendurch auf Eis gekühlt. Die Glasperlen und große Zellbestandteile wurden durch einen Zentrifugationsschritt bei 150 x g und 5 min abgetrennt. Der Rohextrakt wurde geteilt, zu einem Aliquot wurde 1 µg/ml TPCK-Trypsin (Sigma Aldrich) hinzugefügt und das andere Aliquot blieb unbehandelt. Beide Proben wurden für 1 h bei 37 °C inkubiert.

Anschließend wurden die Proben mit 5fach Ladepuffer versetzt und für 10 min bei 95 °C denaturiert.

Die Analyse der Trypsinspaltung erfolgte im Western Blot.

2.4. Hefeproduktion für Immunisierungsversuche